過氧化氫-乙酸聯合預處理對甘蔗渣酶解和發酵的影響

孟繁陽， 李 寧， 史正軍,2， 楊海艷,2， 趙 平,2, 楊 靜,2*

(1.西南林業大學 化學工程學院，云南 昆明 650224； 2.云南省高校特色林木生物質資源化學利用重點實驗室；西南林業大學,云南 昆明 650224)

生物質作為一種綠色、可再生的資源，蘊含著豐富的生物質能，經過熱解、化學和物理法等處理方式可以將其轉變為高附加值的綠色能源和生物基材料[1]，是石油資源的優良替代品。甘蔗屬于禾本科植物，我國甘蔗產量豐富，年產量約為7 000萬噸，榨汁后的甘蔗渣屬于農林廢棄物，直接燃燒或丟棄不僅污染環境，也會造成資源的浪費，其中的生物質能如何合理、高效地利用對于改善我國能源結構具有很高的研究價值[2]。木質纖維生物質主要由纖維素、半纖維素、木質素以及少量的果膠組成，其主要成分之間相互交聯形成了致密的天然抗降解屏障，這些屏障阻礙了纖維素酶對碳水化合物的可及性，使生物質難以被化學或生物利用。生物質經過物理法、化學法、物理化學法和生物法等預處理可以減輕或消除這些屏障的影響，增加酶對碳水化合物的可及性，提高生物質的化學或生物的利用效率[3-5]。本研究采用過氧化氫和乙酸(H2O2-HAc)在濃硫酸催化作用下產生過氧乙酸，并對甘蔗渣進行過氧化氫-乙酸聯合預處理(HPAC)，分別考察溫度和過氧化氫濃度對甘蔗渣酶水解效率和乙醇發酵得率的影響，以及甘蔗渣表面結構特征的變化，探索農林廢棄物預處理及高效酶解的工藝和模式，為生物質煉制燃料乙醇和糖基化合物的研究提供可借鑒的思路和理論依據。

1 實 驗

1.1 材料和試劑

甘蔗渣(SCB)由云南省德宏州英茂糖業有限公司提供，粉碎至0.250～0.380 mm，備用。纖維素酶(Cellic CTec2)由上海Sigma-Aldrich提供，濾紙酶活為250 FPU/mL。酵母，購自宜昌安琪酵母股份有限公司。

過氧化氫(質量分數30%)，乙酸(質量分數99%)，濃硫酸(質量分數98%)，均為市售分析純。檸檬酸緩沖溶液(pH值為4.45)，稀釋20倍pH值為4.8。葡萄糖，購自國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍，購自廣州市賽國生物科技有限責任公司；孟加拉玫瑰紅，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；直接紅，購自成都市科隆化學品有限公司；酵母提取物，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

TU-1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Thermo SCIENTIFIC K-Alpha能譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；Zeiss Sigma 300發射電子顯微鏡，德國Carl-Zeiss-Stiftung公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 甘蔗渣的預處理

1.2.1過氧化氫預處理 20 g甘蔗渣與300 mL的過氧化氫(30%)充分混合，在70 ℃反應2 h，待冷卻后，用蒸餾水沖洗至中性，40 ℃烘箱烘干，備用，命名為HP/70-SCB。

1.2.2乙酸預處理 20 g甘蔗渣與300 mL的乙酸(99%)充分混合，在70 ℃反應2 h，待冷卻后，用蒸餾水沖洗至中性，40 ℃烘箱烘干，備用，命名為AC/70-SCB。

1.2.3過氧化氫-乙酸聯合預處理 將同等體積的過氧化氫和乙酸混合，加入0.5%(體積分數，以過氧化氫和乙酸的總體積計)的濃硫酸作為催化劑。20 g甘蔗渣與300 mL的上述混合液充分混合，在30、 50、 70 ℃反應2 h，按照溫度的不同分別命名為HPAC/30-SCB、HPAC/50-SCB、HPAC/70-SCB。將過氧化氫的濃度降低為原來的1/2，與同等體積的乙酸混合，再加入0.5%的濃硫酸(同上)，在70 ℃反應2 h，待冷卻后，用蒸餾水沖洗至中性，40 ℃烘箱烘干，備用，命名為HPAC/70-SCB- 0.5。

1.3 預處理甘蔗渣的酶水解和發酵

1.3.1預處理甘蔗渣的酶水解 取適量底物(預處理后的甘蔗渣，質量濃度0.05 g/mL)，和纖維素酶5 FPIU/g(基于底物)加入50 mL的錐形瓶中，加入適量的檸檬酸緩沖溶液使反應體系(20 mL)的pH值為4.8，在50 ℃、 150 r/min反應72 h，酶水解過程中定時取樣用以測定酶解過程中的還原糖濃度以及上清液中的酶蛋白質含量[6]。待反應結束后，固液分離，酶水解上清液放置于4 ℃冰箱，用于發酵產乙醇。

1.3.2甘蔗渣水解液的發酵 將葡萄糖(0.05 g/mL)和酵母提取物(0.1 g/mL)混合，加入0.216 g酵母，制備成8 mL的酵母溶液，35 ℃活化30 min。取酶水解上清液4 mL與0.5 mL的酵母溶液混合，并放置于35 ℃培養箱中發酵24 h[7]。

1.4 分析與表征

1.4.1甘蔗渣化學成分測定 原料及預處理甘蔗渣的主要成分測定方法參考GB/T 36058—2018[8]。

1.4.2酶解上清液蛋白質濃度測定 采用Bradford法測定酶解上清液中的纖維素酶蛋白質濃度[9]。取2 mL考馬斯亮藍溶液與0.1 mL水解上清液混合，5 min后反應達到穩定，用紫外分光光度計在595 nm處測定吸光值，制作蛋白質與吸光值的標準曲線，根據吸光值確定蛋白質濃度。

1.4.3疏水度測定 按文獻[10]用玫瑰紅法測定甘蔗渣的疏水度。具體操作如下：分別取不同質量(0、 0.04、 0.08、 0.12、 0.16、 0.20 g)預處理的甘蔗渣與5 mL玫瑰紅染液混合，在50 ℃、 150 r/min反應2 h，離心，取上清液于543 nm處測定吸光值，確定吸附的染液質量和分割熵(PQ，吸附染料與殘余染料之比)。以物料在染液中的濃度為橫坐標，PQ值為縱坐標，進行線性擬合，所得斜率即為底物的疏水度。

1.4.4酶可及度測定 采用直接紅法測定甘蔗渣的酶可及度[11]。操作如下：取0.2 g預處理的甘蔗渣與20 mL不同質量濃度(0、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 g/L)的直接紅染液混合，在50 ℃、 150 r/min反應24 h。離心后取上清液于498 nm處測定染液吸光值，計算吸附的染料質量，使用Langmuir等溫吸附曲線進行非線性擬合，確定底物的酶可及度。

1.4.5XPS分析 采用Thermo SCIENTIFIC K-Alpha能譜儀，X射線能量1 486.8 eV，測試電壓15 kV，在真空2×10-7Pa下測定樣品的X射線能譜。木質素和碳水化合物的表面覆蓋率(S)根據氧碳比(氧原子與碳原子的個數比)求得，其計算公式如下：

SL=(O/C0-O/CC)/(O/CL-O/CC)

(1)

SC=1-SL

(2)

式中：SL—木質素的表面覆蓋率,%；SC—碳水化合物的表面覆蓋率,%；O/C0—底物的氧碳比；O/CL—木質素的氧碳比，0.33；O/CC—碳水化合物的氧碳比，0.83。

1.4.6掃描電鏡分析 采用Zeiss Sigma 300發射電子顯微鏡觀察分析樣品的表面特征，噴金處理，加速電壓為10.00 kV，探測器為InLens，工作距離為7.0 mm，放大倍數為5 000倍。

1.4.7水解液中還原糖和乙醇的測定 酶水解上清液和發酵液通過高效液相色譜儀(Agilent 1260)測定其中的還原糖含量和乙醇濃度，分析柱為Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm，9 μm)，流動相是0.005 mol/L的硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫是55 ℃，在示差折光檢測器(RI)上進行檢測。葡萄糖、木糖和乙醇得率的計算公式如下[12]：

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m×ω1)×100%

(3)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m×ω2)×100%

(4)

Y3=C3/(C4×0.51)×100%

(5)

式中：Y1—葡萄糖的得率，%；C1—水解液中葡萄糖質量濃度，g/L； 0.9—纖維素和葡萄糖的轉化系數； 0.02—水解液的體積，L；m—底物的質量，g；ω1—底物中纖維素的質量分數，%；Y2—木糖得率，%；C2—水解液中木糖質量濃度，g/L； 0.88—半纖維素和木糖的轉化系數；ω2—底物中半纖維素的質量分數，%；Y3—乙醇得率，%；C3—發酵液中乙醇的質量濃度，g/L；C4—發酵液中葡萄糖的初始質量濃度，g/L； 0.51—葡萄糖轉化為乙醇的理論系數。

2 結果與討論

2.1 過氧化氫-乙酸聯合預處理對甘蔗渣化學組分和表面結構特征的影響

2.1.1化學成分 預處理后的甘蔗渣化學組分變化如表1所示。原料甘蔗渣中含纖維素(以葡聚糖表示)、半纖維素(以木聚糖表示)和木質素分別為49.02%、 22.78%和24.38%。過氧化氫(HP)單獨預處理和乙酸(AC)單獨預處理對甘蔗渣的纖維素和半纖維素沒有明顯影響，降低了木質素的質量分數，木質素從原料的24.38%降低至23.57%(HP預處理)和20.65%(AC預處理)，降低了3.3%～15%。然而，經過氧化氫-乙酸聯合預處理后，盡管半纖維素含量沒有明顯的變化，但木質素含量明顯減少。當預處理溫度從30 ℃升高到70 ℃時，HPAC/30-SCB、HPAC/50-SCB和HPAC/70-SCB含木質素分別為17.58%、 9.76%和2.58%，與原料(24.38%)相比降低了27.89%、 59.96%和89.42%，尤其是HPAC/70-SCB，其木質素脫除率達到95.30%，同時91.40%的纖維素被保留在預處理底物中，將有利于后續的酶解糖化過程。

表1 HPAC預處理前后甘蔗渣各組分變化及木質素脫除率

此外，當過氧化氫的濃度降低至原來的1/2，即過氧化氫質量分數為15%時，配制成過氧化氫-乙酸溶液，在70 ℃預處理條件下，甘蔗渣中90.10%的纖維素被保留，HPAC/70-SCB- 0.5含纖維素為62.74%，木質素脫除率為88.85%。與相同預處理條件下30%過氧化氫預處理相比較，木質素的脫除率減少了6.77%，這主要是因為過氧化氫濃度的降低導致過氧乙酸的濃度降低，預處理程度減緩。過氧化氫與乙酸在濃硫酸的催化下生成過氧乙酸，在酸性介質中產生的親電的OH+對木質素上的烯烴基、羰基、芳香環結構具有較高的反應活性，從而導致了木質素的降解，而纖維素中的醇羥基對OH+的反應活性較低，因而僅有少量纖維素被脫除[13]。

2.1.2表面特征 用XPS分析甘蔗渣預處理前后表面化學特征的變化情況，結果見表2。從表2中可以看出，原料甘蔗渣(SCB)的氧碳比和木質素表面覆蓋率分別為0.50和66%，說明原料表面存在大量的木質素[14]；經單獨過氧化氫預處理后的甘蔗渣(HP/70-SCB)的氧碳比提高至0.67，木質素表面覆蓋率降低至32%，說明表面的木質素被部分脫除；經單獨乙酸預處理的甘蔗渣(AC/70-SCB)的氧碳比和木質素覆蓋率沒有明顯變化；而經過氧化氫-乙酸聯合預處理后的甘蔗渣(HPAC/70-SCB- 0.5)的氧碳比增加至0.72，木質素表面覆蓋率降低至22%，木質素表面覆蓋率與單獨過氧化氫和單獨乙酸預處理相比分別降低了31.25%和66.67%，說明HPAC/70-SCB- 0.5表面大量木質素被脫除，并暴露出更多的碳水化合物，因此具有較高的酶可及度和較低的疏水度[15]。

表2 HPAC預處理前后甘蔗渣的氧碳比、表面覆蓋率及C1s譜圖

2.1.3SEM分析 圖1為甘蔗渣預處理前后的表面微觀形貌。如圖所示，未經處理的甘蔗渣原料表面光滑、結構緊密，這意味著酶難以進入甘蔗渣內部，導致水解得率低；而經單獨過氧化氫或乙酸處理后，甘蔗渣表面一定程度被破壞，結構發生斷裂，開始出現孔隙。但是經過氧化氫-乙酸聯合預處理后，由于木質素的大量溶解，甘蔗渣表面出現孔隙率增加，比表面積增大，與纖維素酶的接觸位點增多，這將會使酶可及度明顯增加。

a.SCB; b.HP/70-SCB; c.AC/70-SCB; d.HPAC/70-SCB- 0.5

2.1.4疏水度和酶可及度 甘蔗渣預處理前后的疏水度和酶可及度變化如表3所示。由表可知，原料甘蔗渣的疏水度和酶可及度分別為0.173 L/g和63.34 mg/g，經單獨過氧化氫或乙酸預處理的甘蔗渣疏水度和酶可及度變化不明顯。然而，當采用過氧化氫-乙酸聯合處理后，隨著預處理溫度的升高，底物疏水度呈下降趨勢，而酶可及度呈上升的趨勢，如HPAC/70-SCB的疏水度和酶可及度分別為0.067 L/g和84.54 mg/g，疏水度比HP/70-SCB和AC/70-SCB分別降低了57.86%和60.36%，酶可及分別度增加了45.58%和38.01%，這主要是因為木質素的大量脫除導致底物的親水性增加，使底物更易于參與直接紅染料的吸附。此外，當過氧化氫濃度降低至原來的1/2，預處理底物(HPAC/70-SCB- 0.5)的疏水度和酶可及度與HPAC/70-SCB相比變化不大，分別是0.067 L/g和80.30 mg/g，疏水度比HP/70-SCB和AC/70-SCB分別降低了57.86%和60.36%，酶可及度分別增加了38.26%和31.08%。酶可及度是影響酶解效率的關鍵因素之一，甘蔗渣的親水性增加，對酶的吸附親和力增強；木質素具有疏水性能，與纖維素酶存在疏水性結合，底物的疏水度增高，會使酶與碳水化合物的結合能力減弱[17]，其次木質素的脫除降低了酶的非生產性吸附，使更多的纖維素與酶發生吸附并進行酶解糖化反應。

表3 甘蔗渣預處理前后的疏水度及酶可及度

2.2 過氧化氫-乙酸聯合預處理對甘蔗渣酶解和發酵的影響

2.2.1水解得率和纖維素酶的分布 對原料和預處理后的甘蔗渣加入酶，酶劑量為5 FPIU/g(基于底物)，進行72 h水解，不同時間點的葡糖糖得率、木糖得率和纖維素酶蛋白的分布如圖2所示。從圖中可以看出，SCB、HP/70-SCB、AC/70-SCB的葡萄糖、木糖得率較低，表明單獨過氧化氫和單獨乙酸預處理不能促進SCB的酶降解。然而，當對甘蔗渣進行過氧化氫-乙酸聯合預處理后，酶解得率變化明顯，水解72 h，預處理溫度從30 ℃升高到70 ℃，HPAC/70-SCB的葡萄糖得率從16.83%提高到59.09%，木糖得率從16.77%提高到51.82%。與HP/70-SCB相比，其葡糖糖得率和木糖得率分別提高了3.64倍和4.43倍；與AC/70-SCB相比，分別提高了12.91倍和25.44倍。這表明過氧化氫-乙酸聯合預處理可脫除甘蔗渣中大量木質素，使底物對酶的吸附能力增強，并使還原糖得率明顯提升。此外，將過氧化氫濃度降低至原來的1/2，底物HPAC/70-SCB- 0.5的還原糖得率最優，葡糖糖和木糖得率分別是87.63%和62.78%，明顯高于HPAC/70-SCB。主要是因為過氧乙酸的強氧化作用使纖維素表面乙酰化，阻礙了部分底物對纖維素酶的吸附，使還原糖的得率降低[18]。

在水解反應過程中，大量的酶蛋白先吸附到底物上，參與酶水解反應，使糖苷鍵斷裂，再脫附到水解液中，整個酶水解過程酶在底物上呈現吸附-催化-解吸附-再吸附的過程[19]。在最開始的6 h內，所有底物水解上清液中的酶蛋白含量顯著降低，然后緩緩上升。原料甘蔗渣72 h的水解上清液中酶蛋白質量分數為20.01%；單獨過氧化氫處理和單獨乙酸處理的甘蔗渣72 h水解上清液中酶蛋白質量分數分別為17.15%和16.90%，這表明SCB、HP/70-SCB、AC/70-SCB這3種底物對纖維素酶為不可逆的無效吸附，酶解反應結束后大量的酶蛋白被底物吸附，很難脫附到水解液中參加下一輪的酶解反應，因此糖化效率較低。底物HPAC/70-SCB- 0.5在反應開始的2 h內，纖維素酶快速吸附，水解上清液中的酶蛋白迅速減少到21.22%，反應結束時上清液中的酶蛋白為24.75%，與SCB、HP/70-SCB和AC/70-SCB相比，分別增加了23.69%、 44.31%和 46.45%，表明大量的纖維素酶脫附到上清液中，并再次參與到剩余底物的降解。這是因為HPAC預處理脫除了大量的木質素，從而減少了對酶的非生產性吸附，同時底物表面孔隙率增加，比表面積增大(圖1)，促進酶水解反應的正向進行[20]。

a.葡萄糖 glucose; b.木糖 xylose; c.蛋白質 protein

2.2.2乙醇發酵 按1.3節操作，收集酶水解上清液，加入酵母溶液發酵24 h后，乙醇質量濃度和得率如表4所示。HP/70-SCB和AC/70-SCB的酶水解液經發酵后，其乙醇質量濃度分別為0.99和0.33 g/L，而經過氧化氫-乙酸聯合預處理后的甘蔗渣水解液用于發酵，其乙醇質量濃度明顯提升，且隨預處理溫度升高，乙醇質量濃度越大。HPAC/70-SCB- 0.5的乙醇質量濃度是7.57 g/L，分別是HP/70-SCB和AC/70-SCB的7.65倍和22.94倍。此外，與HPAC/70-SCB的乙醇質量濃度(6.67 g/L)和得率(57.09%)相比，分別提高了13.49%和10.54%，這是因為酶水解后HPAC/70-SCB- 0.5水解液的葡萄糖質量濃度為29.26 g/L，高于HPAC/70-SCB的23.33 g/L，在合適的發酵條件下釀酒酵母能高效地將水解液中的葡萄糖轉化為乙醇，但是HPAC/70-SCB- 0.5的乙醇得率低于65%，主要是因為發酵液中的甲酸、乙酸質量濃度較高，分別為2.53和1.05 g/L，而酸類物質會引起甘蔗渣細胞質的酸化和去極化反應，使乙醇得率降低，在實際生產中可采用活性炭吸附、堿中和、微生物降解等脫毒手段來降低抑制物對乙醇發酵的影響[21-22]。

表4 預處理甘蔗渣水解液發酵的乙醇濃度和產量

3 結 論

3.1過氧化氫-乙酸聯合預處理脫除了甘蔗渣的大部分木質素并使大部分纖維素得以保留。最優條件：20 g的甘蔗渣加入過氧化氫-乙酸溶液300 mL，其中過氧化氫(15%)溶液150 mL，乙酸(99%)150 mL，硫酸用量為0.5%(以過氧化氫-乙酸溶液總體積計)，在70 ℃反應2 h，甘蔗渣的木質素脫除率為88.85%，并有90.10%的纖維素保留。預處理后的甘庶渣HPAC/70-SCB- 0.5的疏水度和酶可及度分別為0.067 L/g和80.30 mg/g，疏水度比單獨過氧化氫預處理(HP/70-SCB)和單獨乙酸預處理(AC/70-SCB)降低了57.86%和60.36%，酶可及度增加了38.26%和31.08%，木質素表面覆蓋率由原料的0.66降低到0.22，碳水化合物暴露在表面，孔隙率增加，比表面積增大。

3.2HPAC/70-SCB在酶用量為5 FPIU/g(以底物計)時進行水解，其葡萄糖得率為59.09%，纖維素表面的乙酰化可能是導致酶解得率低的原因，降低預處理中過氧化氫濃度為原來的1/2，即過氫化氫體積分數為15%時，HPAC/70-SCB-0.5酶解得率明顯提高，其葡萄糖得率為87.63%，發酵產乙醇質量濃度為7.57 g/L。