四氫姜黃素經PI3K/Akt信號通路對人血小板活化和聚集的調控作用

馬永潔，李瑋琪，張春梅，普 俊，牙甫禮,3,*

（1.大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000；2.河口海關，云南 河口 661300；3.大理大學代謝性疾病轉化醫學研究院，云南 大理 671000）

心血管疾病已經成為全球范圍內致死率最高的疾病。血小板作為動脈粥樣硬化和血栓形成的關鍵細胞介質，在心血管疾病的進展中起著至關重要的作用。在某些病理情況下，如高脂血癥、冠心病等，患者循環血液中的血小板可被凝血酶和二磷酸腺苷等可溶性激動劑激活，活化的血小板會釋放一系列的內容物，進而參與促進動脈粥樣硬化和血栓形成和發展。這些內容物主要分為3 類，包括α顆粒、致密顆粒和溶酶體顆粒。其中，血小板α顆粒的含量最為豐富，包括膜結合蛋白CD62P、CD40L等，以及可溶性蛋白如血小板因子-4（platelet factor-4，PF4）、趨化因子配體-5（chemokine ligand 5，CCL5）、-球蛋白等，這些炎癥分子可促進血小板聚集，募集并活化白細胞。此外，ATP、二磷酸腺苷、鈣離子和焦磷酸鹽是致密顆粒的重要內容物，對于介導血小板-白細胞-內皮細胞間的炎癥反應起重要作用。血小板溶酶體顆粒可通過膜蛋白（如CD63）和一些水解酶（如葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等）參與血小板的活化和聚集。大量的研究證實，控制血小板活化是抑制動脈粥樣硬化和血栓形成、防治心血管疾病發生發展的有效策略之一。

膳食營養干預是預防心血管疾病發生發展的關鍵途徑之一。姜黃素是一種天然活性多酚類化合物，主要來源于姜科植物根莖。研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗癌和保護心血管等多種生物學活性。然而，膳食補充姜黃素時，其生物利用度較低（通常小于1%），這是限制其臨床應用的主要因素之一。研究表明，姜黃素經口攝入后，在腸道微生物的作用下迅速轉化為各種代謝物，例如二氫姜黃素、四氫姜黃素（tetrahydrocurcumin，THC）、六氫姜黃素、八氫姜黃素等。其中，THC被認為是最重要、也是活性最高的腸道代謝物，由于具有較高的生物利用度和穩定性，THC可能有潛力開發成為預防或者治療許多慢性疾病的重要物質。本課題組前期的動物實驗也表明，膳食補充THC在緩解小鼠過敏性哮喘方面要優于姜黃素。在血小板功能的調控方面，Mayanglambam等研究發現，姜黃素在體外能抑制血小板的活化；本課題組前期的體外實驗也表明姜黃素可抑制過氧化氫誘導的血小板凋亡。但是，THC對血小板活化和聚集的影響尚不清楚，本研究旨在探討THC對人血小板活化和聚集的影響及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

THC、凝血酶、Fluo-4/AM、熒光素酶試劑美國Sigma-Aldrich公司；FITC偶聯的鼠抗人CD62P抗體、FITC偶聯的鼠抗人CD63抗體、CCL5酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國eBioscience公司；PF4商用ELISA試劑盒美國R&D Systems公司；細胞毒性檢測試劑盒美國Roche公司；磷酸肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、一抗phospho-PI3K（Tyr）、phospho-Akt（Ser）、Akt、-actin、二抗羊抗兔美國Cell Signaling Technology公司；PI3K的激動劑740 Y-P 美國Selleck Chemical公司；瓊脂糖凝膠CL-2B美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

低溫冰箱 青島海爾有限公司；CytoFlex流式細胞儀 美國Beckman Coulter公司；低溫高速離心機德國Eppendorf公司；多功能酶標儀 德國BMG LABTECH公司；血小板聚集儀 北京泰利康信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對象的篩選

研究對象從大理大學校內招募，要求是年齡在25～40 歲之間的健康成人。如果志愿者現在或曾經患有心血管疾病、惡性腫瘤、免疫缺陷病等病史，或濫用藥物、酗酒、吸煙半年以上，或在兩周內服用過抗血小板的藥物（如阿司匹林等），或補充維生素等膳食營養補充劑，則不被納入作為本研究的研究對象。所有志愿者均自愿參與該項目，并均簽署書面知情同意書。

1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備過程

在清晨空腹狀態下，通過靜脈穿刺的方法，抽取并制備枸櫞酸鈉抗凝全血，然后300×、22 ℃離心7 min，血液分3 層，從下往上依次為紅細胞層、白細胞層和富血小板血漿層，為了避免吸到白細胞層，小心吸取并收集上層約2/3的富血小板血漿。將富血小板血漿慢慢滴入裝有瓊脂糖凝膠CL-2B的層析柱，可從富血小板血漿中分離得到純度高（98%以上）、結構完整的純化血小板（即血小板懸液），具體方法參照文獻[10,22-23]。本研究完全按照《赫爾辛基宣言》相關準則進行，并已通過大理大學倫理委員會的批準。

1.3.3 血小板乳酸脫氫酶漏出率的測定

采用細胞毒性檢測試劑盒測定血小板乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出率，并以該指標來評價THC對血小板細胞毒性的影響。首先，取健康人純化血小板與不同濃度的THC（0.1、0.5、1、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L，溶劑為0.05%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或溶劑對照（0.05%DMSO）預孵育40 min，然后離心（12 000×、5 min、22 ℃），用酶標儀測定上清液在490 nm波長處的吸光度（）。同時，將10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）作為陽性對照組，也與血小板共同孵育40 min，用來刺激血小板全部釋放LDH，相同條件下測定490 nm波長處的吸光度（）。血小板LDH漏出率按式（1）計算。

1.3.4 實驗分組

本研究涉及的實驗組別有：1）靜息組：指不經任何處理的血小板懸液，既不經凝血酶激活，也不經DMSO處理；2）模型組：即溶劑對照組（血小板懸液中加入0.05% DMSO，下同）；3）THC組：血小板懸液中分別加入0.5、1、10 μmol/L THC。除了靜息組以外，模型組和THC組的血小板均經凝血酶誘導活化。

1.3.5 流式細胞術測定血小板表面CD62P和CD63的表達量

純化血小板（5×10個/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對照在室溫下共同孵育40 min，用FITC偶聯的鼠抗人CD62P抗體或CD63抗體標記血小板20 min，然后在1 mmol/L Ca存在的條件下，用凝血酶（酶活力不低于2 000 NIH Units/mg蛋白）激活血小板2 min，而靜息組血小板無需凝血酶激活，然后用體積分數1%的多聚甲醛溶液固定，最后利用CytoFLEX流式細胞儀測定血小板表面CD62P和CD63的表達量。

1.3.6 血小板PF4和CCL5釋放量的測定

用PF4和CCL5的商業ELISA試劑盒測定血小板PF4和CCL5的釋放水平，具體方法參照制造商提供的說明書進行。純化血小板（1×10個/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對照預孵育40 min，然后在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min。在12 000×、4 ℃的條件下離心5 min，收集上清液，用ELISA試劑盒的方法測定上清液中PF4和CCL5水平。當探討PI3K/Akt信號通路在THC調控PF4和CCL5釋放中的作用時，實驗設置4個組，即靜息組、模型組、THC（10 μmol/L）組以及THC+740 Y-P組，其中THC+740 Y-P組為THC（10 μmol/L）和PI3K的激動劑740 Y-P（25 μg/mL）與血小板共同孵育40 min，除了靜息組外，各組血小板用凝血酶激活，然后分別檢測這4個組中血小板PF4和CCL5的釋放水平。

1.3.7 血小板ATP釋放量和血小板最大聚集率的測定

將人純化血小板（2.5×10個/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對照預處理40 min，然后加入熒光素酶試劑與血小板共同孵育2 min，在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板，利用血小板聚集儀記錄ATP釋放量和血小板最大聚集率，THC組聚集抑制率按公式（2）計算，由自帶軟件生成THC組聚集抑制率（與模型組相比）隨THC濃度變化的曲線并計算出血小板最大聚集的半數抑制率。具體方法參照文獻[24]。探討PI3K/Akt信號通路在THC調控血小板聚集中的作用時，實驗設置5個組，即靜息組、模型組、THC（10 μmol/L）組、740 Y-P組以及THC+740 Y-P組，其中740 Y-P組為血小板懸液用PI3K的激動劑740 Y-P（25 μg/mL）孵育40 min，THC+740 Y-P組為THC（10 μmol/L）和740 Y-P（25 μg/mL）一同與血小板共同孵育40 min，除了靜息組外，各組血小板用凝血酶激活，然后檢測血小板最大聚集率。

1.3.8 血小板胞內鈣離子濃度的測定

將純化血小板懸液與Fluo-4/AM（0.2 μg/mL）在37 ℃避光孵育30 min 后，離心（3 000×、5 min、37 ℃）沉淀血小板，洗滌后重懸血小板，調整血小板濃度至3×10個/mL，然后與不同濃度的THC在37 ℃避光孵育40 min，使用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min，然后利用酶標儀在激發波長為488 nm、發射波長為520 nm的條件下進行熒光強度的測定，并計算各組的熒光強度與靜息組的熒光強度的比值（即Fluo-4熒光強度比值），以此表征血小板內鈣離子濃度。

1.3.9 免疫印跡法檢測蛋白表達

將人純化血小板（2.5×10個/mL）與不同濃度的THC（0.5、1、10 μmol/L）或溶劑對照在體外共同孵育40 min，在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板5 min后，離心（12 000×、15 min、4 ℃），棄上清液，在冰上用細胞裂解液對血小板裂解30 min，然后離心（12 000×、15 min、4 ℃），收集上清液得到血小板蛋白，測定蛋白濃度后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測血小板PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表達水平。

1.4 數據統計與分析

實驗結果用平均值±標準誤表示，用SPSS 20.0統計軟件通過單因素方差分析進行多組間比較，采用Newman-Keuls test法進行組間兩兩比較，雙側＜0.05表示差異具有統計學意義；同時采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。所有實驗的數據統計結果至少來自3個獨立的志愿者樣本。

2 結果與分析

2.1 THC對血小板細胞毒性的影響

如圖1所示，與陽性對照組（10% SDS）相比，溶劑對照組（0.05% DMSO）以及不同濃度的THC（0.1～320 μmol/L）組中血小板的LDH漏出率高度顯著降低（＜0.001）。THC在0.1～80 μmol/L的濃度范圍內LDH漏出率與溶劑對照組相比無顯著差異（＞0.05），因此可以認為，在這個濃度范圍內，THC對健康人純化血小板無明顯的細胞毒性作用。但是160 μmol/L和320 μmol/L濃度的THC呈現顯著的細胞毒性作用，因為其LDH漏出率與對照組相比顯著或極顯著升高（＜0.05、＜0.01）。另外，綜合對比其他研究報道中所用THC濃度，最終選擇0.5、1 μmol/L和10 μmol/L進行后續的實驗。

圖1 THC對血小板細胞毒性的影響Fig. 1 Cytotoxic effect of THC on platelets

2.2 THC對血小板CD62P的表達量以及PF4和CCL5釋放量的影響

如圖2A所示，流式細胞術結果表明，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可分別顯著（＜0.05）和高度顯著（＜0.001）抑制凝血酶誘導的血小板表面CD62P的表達，低濃度（0.5 μmol/L）的THC并不能顯著抑制CD62P的表達（＞0.05）。如圖2B、C所示，與模型組相比，凝血酶誘導的血小板PF4的釋放水平也被1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC顯著抑制（＜0.05、＜0.001）；10 μmol/L濃度的THC可極顯著抑制凝血酶誘導的血小板CCL5的分泌（＜0.01）。以上實驗說明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導的血小板α顆粒的釋放。

圖2 THC對血小板表面CD62P表達量（A）以及PF4（B）和CCL5（C）釋放的影響Fig. 2 Effect of THC on platelet surface expression of CD62P (A) and the release of PF4 (B) and CCL5 (C)

2.3 THC對血小板ATP釋放量和胞內鈣離子濃度的影響

如圖3所示，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可極顯著降低凝血酶誘導的血小板ATP釋放水平和胞內鈣離子濃度（＜0.01），但是0.5 μmol/L的THC并不能顯著降低ATP釋放量和胞內鈣離子濃度（＞0.05）。THC對ATP釋放水平和胞內鈣離子的抑制作用在1 μmol/L濃度組和10 μmol/L濃度組間無統計學差異（＞0.05）。以上結果說明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導的血小板致密顆粒的釋放。

圖3 THC對血小板ATP釋放量（A）和胞內鈣離子濃度（B）的影響Fig. 3 Effect of THC on platelet ATP release (A) and intracellular calcium concentrations (B)

2.4 THC對血小板CD63表達的影響

如圖4所示，流式細胞術分析結果表明，凝血酶可明顯促進血小板表面CD63的表達，10 μmol/L濃度的THC高度顯著抑制血小板表面CD63的表達（＜0.001），但是0.5 μmol/L和1 μmol/L濃度的THC并不能顯著抑制CD63的表達（＞0.05）。以上結果說明10 μmol/L THC可抑制凝血酶誘導的血小板溶酶體顆粒的釋放。

圖4 THC對血小板表面CD63表達的影響Fig. 4 Effect of THC on platelet surface expression of CD63

2.5 THC對血小板聚集的影響

如圖5A所示，與模型組相比，1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可高度顯著降低凝血酶誘導的血小板最大聚集率（＜0.001），而且兩組的血小板最大聚集率之間無顯著差異（＞0.05）。0.5 μmol/L的THC對血小板最大聚集率與模型組相比無顯著差異（＞0.05）。THC在0.1～20 μmol/L濃度范圍內對血小板最大聚集抑制率的影響見圖5B，THC在0.5～10 μmol/L濃度范圍內，血小板最大聚集抑制率隨著濃度的增加而升高，THC抑制血小板最大聚集的半數抑制濃度為（0.74±0.03）μmol/L。

圖5 THC對血小板聚集的影響Fig. 5 Effect of THC on platelet aggregation

2.6 THC對血小板PI3K/Akt信號通路活化的影響

如圖6所示，凝血酶可明顯促進血小板PI3K（Tyr）和Akt（Ser）發生磷酸化。與模型組相比，0.5、1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可顯著下調凝血酶誘導的血小板PI3K的磷酸化水平（＜0.01、＜0.001、＜0.001），其中1 μmol/L和10 μmol/L THC兩組間則無顯著差異（＞0.05）。與模型組相比，凝血酶誘導的血小板Akt磷酸化水平可被1 μmol/L和10 μmol/L的THC所抑制（＜0.05、＜0.001），而且兩組之間無顯著差異（＞0.05）。以上結果說明THC可抑制凝血酶誘導的血小板PI3K/Akt信號通路的活化。

圖6 THC對血小板PI3K/Akt信號通路活化的影響Fig. 6 Effect of THC on platelet PI3K/Akt signaling pathway

2.7 THC經PI3K/Akt信號通路對血小板活化和聚集的影響

如圖7所示，PI3K的特異性激動劑740 Y-P可部分逆轉THC對凝血酶誘導的血小板PF4和CCL5的釋放和血小板聚集的抑制作用，因為THC+740 Y-P組相對于單獨的THC（10 μmol/L）組血小板PF4和CCL5的釋放水平以及血小板最大聚集率顯著或極顯著升高（＜0.05、＜0.01），但是相對于模型組顯著降低（＜0.05、＜0.01）。說明THC對血小板活化和聚集的影響與其下調PI3K/Akt信號通路有關。

圖7 THC經PI3K/Akt信號通路對血小板活化和聚集的影響Fig. 7 THC regulated platelet activation and aggregation through PI3K/Akt signaling pathway

3 討 論

血小板異常活化和聚集可促進動脈粥樣硬化和血栓形成，在心血管疾病的發生發展過程中發揮重要作用。膳食補充姜黃素可發揮抑制動脈粥樣硬化形成和保護心血管疾病的作用，但是具體機制尚不清楚。本研究發現，姜黃素的主要腸道代謝物THC在體外可顯著抑制凝血酶誘導的血小板活化和聚集，提示THC在抗血小板高反應性方面具有潛在的實用價值。

研究已經證實，心血管疾病患者循環血液中高濃度的凝血酶和二磷酸腺苷等可直接激活血小板，活化的血小板分泌大量的顆粒物質，內含有重要的炎癥因子，這些因子是介導血小板-白細胞-內皮細胞間相互作用的關鍵介質。例如，活化的血小板表面可表達大量的CD62P，CD62P是α顆粒中最重要的分子之一，它可通過與白細胞和內皮細胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）相結合發揮直接與白細胞和內皮細胞相互黏附的作用，進而使白細胞和內皮細胞發生活化，并促進其凋亡，這對于血小板促進早期的動脈粥樣硬化血栓形成極為關鍵。研究表明，血小板基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化和血栓形成量顯著減少，這與基因敲除小鼠中血小板-白細胞-內皮細胞間的相互黏附受到抑制密切相關。另外，血小板分泌的PF4和CCL5可促進血小板活化和聚集，并能募集單核細胞到達損傷的血管內皮處，并促進內皮細胞活化和分化。Mayanglambam等通過體外研究發現，姜黃素可顯著抑制膠原誘導的血小板表面CD62P的表達和血小板聚集反應，但是其腸道代謝物THC對血小板活化和聚集的影響尚鮮見報道。本研究結果表明，THC可顯著抑制血小板活化，如抑制凝血酶誘導的血小板表面CD62P和CD63的表達，同時抑制血小板PF4、CCL5和ATP的釋放。這些對于THC抑制動脈粥樣硬化和血栓形成，以及防治心血管疾病發展可能具有重要意義，但是在體內實驗中，THC對血小板活化和聚集、血小板-白細胞-內皮細胞間相互作用和動脈粥樣硬化血栓形成的影響仍值得進一步探討。

調控血小板活化和聚集的分子機制錯綜復雜，研究表明，PI3K/Akt信號通路在其中起重要作用。當血小板受到激動劑激活時，引起胞內鈣離子濃度升高，進而促進下游PI3K/Akt信號通路的活化，從而進一步激活血小板整合素αIIbβ3的活化，引起血小板顆粒物的釋放和血小板聚集增加。通過敲除血小板基因或者，則使血小板不能很好地發生活化和聚集。PI3K/Akt信號通路在THC抑制腫瘤細胞增殖和分化中起重要作用，但是其在THC調控血小板功能方面的機制尚不清楚。本研究發現THC可顯著降低模型組胞內鈣離子濃度，并下調PI3K和Akt的磷酸化水平，而且PI3K的特異性激動劑740 Y-P可部分逆轉THC對血小板活化和聚集的抑制作用，證明THC抑制血小板活化和聚集與其下調PI3K/Akt信號通路有關，同時也說明其他信號通路也可能參與其中。之前的研究表明，姜黃素可通過糖蛋白VI（glycoprotein VI，GPVI）/脾源性酪氨酸蛋白激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）/磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）信號通路抑制膠原誘導的血小板活化和聚集，而THC是否也對這條信號通路起調控作用需要今后的實驗進一步證實。

本課題組之前的動物實驗發現，每天以800 mg/kg飼料的劑量給小鼠膳食補充姜黃素和THC，喂養25 d后，姜黃素組和THC組小鼠血漿中THC的濃度分別為0.2 μmol/L和0.9 μmol/L，而且在這個劑量下，小鼠未觀察到明顯的毒副反應。本實驗根據體外細胞毒性實驗結果和之前的動物實驗中小鼠血漿的THC濃度，選擇的THC濃度范圍為0.5～10.0 μmol/L，該濃度范圍涵蓋生理劑量和藥理劑量，并且與其他報道的體外研究中所使用的THC濃度接近。日常生活中經常食用咖喱的人群中，姜黃素的日攝入量可達10 g，而THC作為姜黃素的主要腸道代謝物，其對人體的安全性可以確定。本研究發現THC可抑制血小板活化和聚集，在體內實驗中，膳食補充THC是否影響凝血過程仍值得深入探討；另外，THC是否有望開發成為安全的抗血小板藥物也需更多的實驗證實。目前國內外在THC量化生產方面進行了不斷地探索，其體外合成途徑主要有化學合成和生物合成。在化學合成方法中，主要是通過利用姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素進行氫化而得到，或者采用新型催化劑在室溫下直接將姜黃素還原為THC，此方法適用于工業化生產。在生物合成方法中，有酵母生物轉化法和大腸桿菌合成法等。目前微生物轉化法進行THC的生產已成為研究的熱點，它可能成為今后提高THC工業化生產的重要途徑。

本研究發現姜黃素的腸道代謝物THC能夠顯著抑制凝血酶誘導的人血小板活化和聚集，其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路有關。總之，本研究從營養膳食或從功能食品途徑為姜黃素和THC防治心血管疾病提供了一定的理論依據。