凍融循環對熟制鰹魚暗色肉脂質變化的影響

樓丹露，王清政，鄒祖全，谷貴章，胡奇杰，張進杰，徐大倫,*

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800；2.寧波大學醫學院，浙江 寧波 315800；3.湖州食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州 313000）

鰹魚俗稱炸彈魚，屬金槍魚科、鰹屬，其營養物質含量豐富，是符合人體健康的理想食品。鰹魚產量約占世界金槍魚總產量的48%以上，且目前鰹魚的捕撈量相對較穩定，在未來捕撈量還可能有所上升。鰹魚的可食部位可分為白色肌肉組織和暗色肌肉組織，白色肉的外觀、營養、質地及口感較優，可加工成魚肉罐頭、魚松、魚片等直接食用。而暗色肉因為腥味重、肉色暗紅且具有不良的口感，因此不易被人接受，但暗色肉作為鰹魚的副產品，富含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不飽和脂肪酸，還含有豐富的血紅素鐵，能滿足不同人群的營養需求。因此，暗色肉被大多數鰹魚加工企業作為二次加工的原料，這也促進了對鰹魚副產品資源的合理利用。

冷凍是目前長途運輸、貯藏及銷售過程中保證水產品品質的重要手段。但現如今我國冷鏈技術管理尚不完善，冷凍水產品在長途貯運過程中受環境溫度波動影響會出現反復凍融的現象。凍融會使小冰晶融化并隨后形成更大且更不規則的晶體，冰晶的生長會給肌肉組織造成不可逆的機械性損傷，致使水產品細胞破裂，促氧化物質（血紅素鐵）釋放，加速脂質氧化分解、蛋白質劣變。Wang Bo等發現在凍融過程中，冰晶體和重結晶的形成會破壞豬肉餡餅肌肉組織，加速脂質氧化反應以及誘導丙二醛的形成。Yu Manman等研究發現在脂肪酶和脂氧合酶的作用下，海螺在冷藏期間會發生脂質的水解和氧化。合理的脂質氧化會賦予食品特有的風味，然而過度氧化會使脂肪酸進一步分解成一些醛、酮、酸類小分子化合物，導致產品酸敗劣變，影響產品風味。熟制鰹魚暗色肉作為二次加工的原料，在加工前有一個長途運輸、貯藏的過程，因此會不可避免地產生反復凍融的現象，致使暗色肉在凍融循環過程中脂質發生變化。

本實驗旨在以熟制鰹魚暗色肉作為原料模擬長途運輸、貯藏過程中的凍融循環，研究凍融循環過程中暗色肉的脂質組成、脂肪酸組成以及脂質氧化程度的變化，并進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和相關性分析，探究凍融循環-脂質組成-脂質氧化程度三者之間的相關性規律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熟制鰹魚暗色肉塊 寧波凱創冷凍食品有限公司。

甘油三酯（triacylglycerol，TAG）試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；三氯乙酸、冰乙酸、硫代硫酸鈉、甲醇、氫氧化鉀、乙醚、異丙醇、酚酞、碘化鉀、氯化鈉、正己烷、乙酸、氯仿、三氟化硼、硝酸、高氯酸、鉬酸鈉、氧化鋅、鹽酸、硫酸聯氨、磷酸二氫鉀、濃硫酸、吡啶、正庚烷、乙酸銅、油酸等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；DocuMeter pH計 德國Sartorius 公司；RV-10型旋轉蒸發儀 德國IKA公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；BCD-539WL冰箱青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凍融循環處理

在聚苯乙烯泡沫箱中裝入碎冰，將熟制鰹魚暗色肉塊（每塊約500 g）置于碎冰中并在3 h內運至實驗室。將肉塊切分為9 cm×3 cm×3 cm的長方體，然后用聚氯乙烯袋（17 cm×23 cm）分裝，每袋分裝質量約50 g。分裝后一部分用于對照組（未經過凍融循環處理）的指標測定，另一部分用于凍融循環處理。

凍融循環處理參考文獻[5]的方法并稍作修改，取分裝好的暗色肉樣品放入-20 ℃冰箱中冷凍貯藏5 d，取出后于4 ℃冰箱中解凍12 h，作為1 次凍融，再放回-20 ℃下進行冷凍貯藏，重復上述步驟，共凍融8 次，并在凍融2、4、6、8 次后取樣測定相關指標。

1.3.2 pH值的測定

pH值的測定參照文獻[9]的方法并稍作修改，取2 g樣品，加入18 mL去離子水，25 000 r/min均質1 min，靜置30 min后冷凍離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min），取上清液用pH計測定pH值。

1.3.3 過氧化值的測定

過氧化值（peroxide value，POV）的測定參照文獻[10]。

1.3.4 酸價的測定

酸價（acid value，AV）的測定參照文獻[11]。

1.3.5 脂質的提取

脂質提取參照文獻[12]的方法并稍作修改。采用真空冷凍干燥技術對魚肉樣品進行凍干處理，取10 g凍干的熟制鰹魚暗色肉，加入200 mL氯仿-甲醇溶液（體積比為2∶1），超聲1 h，4 ℃浸提24 h，濾紙過濾后，濾液與50 mL 0.9%（質量分數）氯化鈉溶液充分混合，靜置分層后取氯仿層（下層），經無水硫酸鈉干燥后在45 ℃下旋轉蒸發，氯仿完全蒸發后得到脂質樣品，用于后續指標的測定。

1.3.6 甘油三酯質量分數的測定

參照文獻[13]的方法采用試劑盒測定1.3.5節所提取脂質樣品中TAG的質量分數。

1.3.7 磷脂質量分數的測定

參照文獻[14]中的鉬藍比色法測定1.3.5節脂質樣品中磷脂（phospholipid，PL）的質量分數。

1.3.8 游離脂肪酸質量分數的測定

參照文獻[15]的方法并稍作修改，采用銅皂比色法測定1.3.5節脂質樣品中游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）的質量分數。將脂質樣品用氯仿溶解并定容至50 mL，在45 ℃下旋轉蒸發，氯仿完全蒸發后加入3 mL正庚烷溶解，振蕩1 min后加入1 mL銅試劑（5%（質量分數）乙酸銅溶液，用吡啶調至pH 6.1），振蕩2 min，靜置10 min后于715 nm波長處測定樣品吸光度，以油酸為對照樣品繪制標準曲線，根據標準曲線計算FFA的質量分數。

1.3.9 脂質分級與脂肪酸成分分析

參照文獻[16]進行脂質分級并稍作修改，利用氨基固相萃取小柱將1.3.5節脂質樣品分為TAG、PL和FFA組。先用5 mL氯仿活化小柱，然后取1.3.5節脂質樣品溶于1 mL氯仿后上樣，分別用9 mL氯仿-異丙醇（體積比2∶1）、7 mL 25%（質量分數）乙酸-乙醚和16 mL甲醇依次洗脫TAG、PL和FFA。分別收集對應的洗脫液并用氮氣吹干，于-20 ℃凍存，備用。

參照文獻[17]的方法進行測定并稍作修改。將1.3.5節脂質樣品及其洗脫后的脂質組分（TAG、FFA和PL）制備為脂肪酸甲酯，然后進行脂肪酸成分分析。樣品制備方法如下：取10～60 mg樣品，加入2 mL 0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液，60 ℃皂化30 min，冷卻至室溫（約25 ℃）后，再加入2 mL 25%（質量分數）的BF-甲醇溶液，60 ℃酯化20 min，再次冷卻至室溫后，加入2 mL正己烷，振搖2 min使溶液充分混勻，然后加入2 mL飽和NaCl溶液以除去混合溶液中的水。靜置分層后取1 mL有機相（上層）用于脂肪酸分析。

氣相色譜條件：DB-23毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），氦氣流速1 mL/min，分流進樣，分流比30∶1，進樣體積1 μL；進樣口與接口溫度均為270 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至160 ℃，再以8 ℃/min升至210 ℃，最后以3.15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

質譜條件：電子電離電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度270 ℃，掃描范圍35～500/。

定性定量分析：實驗數據與NIST 11譜庫數據庫相匹配，概率得分低于50（最大值100）的組分視為未鑒定出，不同脂質成分中脂肪酸的含量采用內標法計算，結果表示為mg/g（以凍干魚肉質量計）。

1.4 數據處理與分析

實驗設置3個平行，結果以平均值±標準差表示。采用Excel軟件進行數據處理，采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析。采用MetaboAnalyst 5.0數據庫（https://www.metaboanalyst.ca/）進行PCA、PLS-DA和相關性分析。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 凍融循環對熟制鰹魚暗色肉pH值的影響

pH值是評價所建立模擬模型合理性的一個重要指標。熟制鰹魚暗色肉在凍融過程中的pH值的變化如圖1所示。魚肉在未經過凍融時呈弱酸性，可能的原因為鰹魚體內積累了乳酸，使得魚肉肉質偏酸。隨著凍融次數的增加，鰹魚暗色肉的pH值呈現逐漸下降的趨勢，凍融8 次后pH值從6.83（凍融0 次）下降至6.44。這可能是因為在反復凍融的過程中，冰晶體對魚肉肌肉組織造成不可逆的機械性損傷，導致魚肉的持水能力下降并且蛋白質發生變性，氫離子釋放，致使pH值降低。

圖1 凍融循環對熟制鰹魚暗色肉pH值的影響Fig. 1 Effect of F-T cycle on pH of dark meat of cooked bonito

2.2 凍融循環過程中熟制鰹魚暗色肉過氧化值和酸價的變化

POV是評價脂質氧化初級階段過氧化產物生成的重要指標。由圖2可知，在未經過凍融時（凍融0 次），熟制鰹魚暗色肉的POV為0.49 g/100 g，隨凍融次數的增加POV逐漸增加，凍融8 次的樣品POV達到1.61 g/100 g，這一現象說明低溫雖然能夠延長水產品的貨架期，但是脂質氧化現象仍然存在。更重要的是，暗色肉含有豐富的血紅素鐵，凍融循環過程中由于溫度波動，形成的不規則冰晶體會對魚肉組織細胞造成損傷，導致血紅素鐵等促氧化物質釋放，加速了冷凍和解凍過程中脂質的氧化，過氧化物逐漸累積。此外，在凍融后冰晶升華，肌肉中出現海綿狀孔隙結構，脂質與空氣接觸面增大也會加劇脂質氧化。Pan Na等發現隨著凍融次數的增加，速凍肉餅中脂質氧化程度加劇。此外，鰹魚暗色肉富含多不飽和脂肪酸，有研究表明多不飽和脂肪酸相較于單不飽和脂肪酸更容易發生氧化。

圖2 凍融循環對熟制鰹魚暗色肉POV和AV的影響Fig. 2 Effects of F-T cycles on POV and AV of dark meat of cooked bonito

凍融循環對鰹魚暗色肉AV的影響如圖2所示，在未經過凍融時，魚肉的AV為11.20 mg/g，隨著凍融次數的增加，AV逐漸增加。與凍融0 次魚肉相比，凍融8 次后，熟制鰹魚暗色肉的AV（18.94 mg/g）增加了7.74 mg/g。這可能是因為熟制鰹魚暗色肉中的脂質在凍融循環過程中氧化產生的初級產物進一步分解成小分子醛、酮、酸等化合物，隨著凍融次數的增加，這些小分子化合物不斷積累，從而使AV在凍融循環過程中呈總體上升的趨勢。此外，溫度波動有利于某些微生物（如嗜冷菌等）的生長，嗜冷菌等微生物產生的脂氧化酶會加劇脂質氧化酸敗，導致AV升高。凍融循環過程中AV的變化與pH值分析結果相印證，即隨著凍融次數的增加，暗色肉的酸性顯著降低（＜0.05）。Yu Manman等研究發現新鮮海螺在冷藏10 d后，AV由32.48 mg/g升高至71.78 mg/g，與本研究結果相似。

2.3 凍融循環過程中熟制鰹魚暗色肉脂質組成的變化

熟制鰹魚暗色肉在凍融過程中脂質組成變化如表1所示，凍融0 次魚肉所提取的脂質樣品中，TAG的質量分數（74.12%）最高，FFA的質量分數為11.14%，PL的質量分數為6.51%。說明TAG是最主要的脂質成分，其次是FFA和PL。凍融循環對魚肉的脂質組成有明顯的影響，TAG的質量分數隨著凍融次數的增加不斷減少，從74.12%（凍融0 次）減少至67.50%（凍融8 次），PL的質量分數也逐漸下降，但FFA的質量分數從凍融0 次的11.14%增加到凍融8 次的17.57%。可能的原因為凍融過程中一些生化反應仍在進行，溫度波動有利于某些嗜冷微生物的生長繁殖，這些微生物會產生脂肪酶，催化TAG和PL發生水解，TAG水解生成甘油二酯和甘油一酯，PL水解成甘油、磷酸和脂肪酸，導致FFA的質量分數升高。此外，Yu Manman等研究表明PL的水解與海螺中磷脂酶的活性密切相關，并發現脂質水解導致FFA的含量增加，PL和TAG的含量降低。

表1 熟制鰹魚暗色肉在凍融循環過程中脂質組成的變化Table 1 Changes in lipid composition in dark meat of cooked bonito during F-T cycles

2.4 凍融循環過程中熟制鰹魚暗色肉脂質中脂肪酸組成的變化

熟制鰹魚暗色肉在經過凍融循環后脂肪酸的組成變化如表2所示。熟制鰹魚暗色肉共鑒定出18種脂肪酸，其中總單不飽和脂肪酸的含量最高，總飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸次之。飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸中含量最高的脂肪酸分別是棕櫚酸（C）、油酸（C）和EPA。白冬的研究發現鰹魚魚肉中C和硬脂酸的含量均較高且鰹魚各個部位的DHA和EPA等多不飽和脂肪酸含量豐富，本研究結果與其一致。凍融0 次與凍融8 次樣品的總單不飽和脂肪酸含量沒有發生顯著變化（＞0.05）。但隨著凍融次數的增加，總飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸均略有下降，總飽和脂肪酸含量由凍融0 次的108.21 mg/g降低到凍融8 次的98.12 mg/g，總多不飽和脂肪酸含量由凍融0 次的71.21 mg/g下降到凍融8 次的61.08 mg/g。其中EPA和DHA的含量隨著凍融次數的增加也不斷減少，分別在凍融8 次時降至18.22 mg/g和16.48 mg/g，可能的原因為鰹魚暗色肉脂肪酸含量豐富，在凍融過程中極易發生氧化且相較于飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，多不飽和脂肪酸更容易發生自氧化，這可能與其自身具有較多的不飽和雙鍵有關，且凍融循環在某種程度上降低了魚肉的營養價值。此外，隨著凍融次數的增加，不同大小和分布的冰晶體對肌肉組織有不同程度的破壞作用，導致一些促氧化因子釋放，加速脂肪酸氧化降解成小分子化合物，進而導致脂肪酸含量降低。此外，多不飽和脂肪酸氧化分解會產生小分子化合物（如酸類物質），導致AV升高，與本研究AV的變化趨勢相互印證。彭珠妮研究發現水煮牛肉在冷藏期間單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量相對穩定，多不飽和脂肪酸更易氧化。Zhou Xin等在研究貽貝肉時有同樣的發現，隨著冷藏時間的延長，貽貝肉中多不飽和脂肪酸的含量減少。

表2 凍融循環過程中脂質中脂肪酸組成的變化Table 2 Changes in fatty acid composition of total lipids during F-T cycles

2.5 凍融循環過程中3種脂質成分中脂肪酸組成的變化

為了進一步探究熟制鰹魚暗色肉在凍融循環過程中脂質的變化，本實驗分別分析了TAG、PL和FFA中的脂肪酸組成。凍融循環過程中暗色肉TAG和PL中脂肪酸組成的變化情況如表3、4所示。隨著凍融次數的增加，TAG和PL中脂肪酸總量均減少，其中TAG中C含量從凍融0 次的44.16 mg/g下降到凍融8 次的40.61 mg/g；C含量從凍融0 次到凍融8 次下降了10.02 mg/g。此外，PL中總飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸含量顯著下降（＜0.05），特別是總多不飽和脂肪酸含量從凍融0 次時的12.90 mg/g降至凍融8 次的7.73 mg/g，其中，在總飽和脂肪酸和總多不飽和脂肪酸中含量最高的C和DHA分別在凍融8 次后含量分別下降了1.53 mg/g和4.18 mg/g。可能的原因為凍融過程中多不飽和脂肪酸極易氧化，且溫度的波動有利于部分微生物的生長繁殖，其產生的脂肪酶會催化脂質氧化水解，隨著凍融次數的增加，TAG和PL中脂肪酸的含量逐漸減少，FFA被釋放出來。這一結果與2.3節脂質的組成變化結果相印證。

FFA是脂肪氧化的主要底物，在肉制品風味形成中發揮著重要的作用。由表5中可知，隨著凍融次數的增加，FFA中的總多不飽和脂肪酸從凍融0 次的17.76 mg/g增加到凍融8 次的37.72 mg/g，總單不飽和脂肪酸由10.22 mg/g增長到15.22 mg/g。相較于凍融0 次樣品，暗色肉凍融8 次后C的含量增加了2.54 mg/g，EPA和DHA的含量也分別增加了6.87 mg/g和11.18 mg/g。Zhou Xin等也發現貽貝在冷藏期間FFA的含量增加，TAG和PL的含量減少。此外，凍融8 次與凍融6 次相比較，總飽和脂肪酸和總單不飽和脂肪酸的含量降低，主要原因可能是FFA被氧化成小分子風味化合物。

表3 凍融循環過程中TAG中脂肪酸組成的變化Table 3 Changes in fatty acid composition of TAG during F-T cycles

表4 凍融循環過程中PL中脂肪酸組成的變化Table 4 Changes in fatty acid composition PL during F-T cycles

表5 凍融循環過程中FFA中脂肪酸組成的變化Table 5 Changes in fatty acid composition of FFA during F-T cycles

2.6 凍融循環過程中脂質組分質量分數與脂質氧化指標之間的關系

采用PCA、PLS-DA和相關性分析對熟制鰹魚暗色肉在凍融循環過程中POV、AV、pH值以及脂質組分中TAG、PL和FFA的質量分數之間的相互關系進行了評價。如圖3A所示，PC1和PC2方差貢獻率分別為88.1%和6.4%，累計方差貢獻率大于85%，說明PC1和PC2能較好地反映總體的特征，且不同凍融次數的魚肉分布的位置距離較遠易于區分，表明經過不同凍融次數的魚肉之間存在一定差異性。凍融8 次熟制鰹魚暗色肉與AV、POV和FFA質量分數的距離較近，說明其存在一定的相關性，可能的原因是暗色肉在凍融8 次后脂質氧化程度較嚴重。變量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）是用來衡量凍融循環對脂質氧化影響程度的指標。VIP＞1說明影響力較大，由圖3B可知，VIP＞1的指標主要包括AV、TAG、FFA和POV，表明這幾個指標可以區分凍融8 次的樣品與未凍融的樣品。POV、AV、pH值、TAG質量分數、PL質量分數和FFA質量分數之間的相關性分析結果如圖3C所示，FFA質量分數與POV、AV呈正相關，與PL質量分數、TAG質量分數、pH值呈負相關。

圖3 凍融循環對熟制鰹魚暗色肉中3種脂質質量分數與脂質氧化指標之間的相關性分析結果Fig. 3 Correlation analysis of contents of three lipid components and lipid oxidation indices in dark meat of cooked bonito during F-T cycles

3 結 論

熟制鰹魚暗色肉在凍融循環過程中，隨著凍融次數的增加，魚肉的POV和AV逐漸升高，pH值和總多不飽和脂肪酸含量逐漸降低，表明在凍融循環過程中脂質發生氧化分解且隨著凍融次數的增多氧化程度加劇。此外，脂質不同組分的含量有顯著的變化，隨著凍融次數的增加，TAG和PL的質量分數明顯降低，FFA的質量分數明顯升高。TAG和PL中總飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量隨著凍融次數的增加不斷降低，FFA中總多不飽和脂肪酸的含量逐漸升高，說明凍融過程中TAG和PL水解，釋放出FFA。最后通過PCA、PLS-DA和相關性分析對熟制鰹魚暗色肉在凍融循環過程中POV、AV、pH值、TAG質量分數、PL質量分數和FFA質量分數之間的相互關系進行評價，結果表明經過不同凍融次數的魚肉之間存在差異性，且熟制鰹魚暗色肉在凍融8 次后脂質氧化程度較嚴重。此外，FFA與POV、AV呈正相關，與PL、TAG、pH值呈負相關，說明凍融循環會影響熟制鰹魚暗色肉脂質組成，同時引起脂質發生氧化分解。本實驗為探究水產品及其半成品在長途貯運過程中脂質的變化提供參考，且對水產品及其半成品在長途貯運過程中延緩脂質氧化分解措施的選擇也具有一定的幫助。