全外顯子組測序在9p缺失綜合征診斷中的應用

易 薇， 番云華， 劉厚昌， 禹崇飛， 楊必清， 葛世軍， 林克勤， 褚嘉祐， 楊昭慶

（1.云南省德宏州人民醫院檢驗科，云南 芒市 678400；2.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所醫學遺傳學研究室，云南 昆明 650118）

9p部分單體或9p末端缺失可導致9p缺失綜合征。XY核型的男性9p缺失綜合征患者在臨床上會表現出男性性反轉現象，導致SRXY4綜合征[1]。XX核型的女性9p缺失綜合征患者國內外均鮮有報道，因此9p缺失對女性子宮、卵巢等生殖系統的發生和發育造成的影響目前尚不清楚。既往對9p缺失綜合征的報道多為成年男性，由于總體上報道的病例數不多，且不同病例在臨床表現上呈現出異質性，除男性性反轉外，目前尚未建立起較為明確的9p缺失綜合征的基因型-表型關聯性，其分子病理基礎尚不清楚。鑒定9p缺失綜合征表型相關的候選基因并探討其表型關聯性，對該病的臨床診治、預后判定和遺傳咨詢具有重要的意義。本研究采用染色體核型分析和全外顯子組測序相結合的方法，分析1例具有子宮發育不全而無面容異常和智力語言障礙的XX核型的女性9p缺失綜合征患者，以提高臨床對此類疾病的認識。

1 材料和方法

1.1 研究對象

患者，女，19歲，以成年后月經未來潮就診。患者自訴有癲癇病史。體格檢查未發現身高、體質量、面容、四肢等存在異常。無語言障礙，無智力障礙，無運動發育遲緩。B超結果示幼稚子宮。實驗室檢查示血常規、肝腎功能、心肌酶、甲狀腺功能無異常。性激素檢測示性激素異常，無卵泡成熟：雌二醇20.04 pmol/L，促卵泡成熟激素2.51 IU/L，黃體生成激素1.39 IU/L，泌乳素206.9 mIU/L，孕酮0.94 nmol/L，人絨毛膜促性腺激素<0.10 IU/L。臨床診斷為原發性閉經和原發性性腺功能減退，經激素治療，閉經癥狀有所緩解并有持續性月經。患者的父母健康狀況良好，表型正常，否認近親婚配，否認家族遺傳病史，否認孕期感染病史及放射性物質和有毒物質接觸史。

1.2 方法

1.2.1 染色體G顯帶核型分析 經患者及其父母知情同意，采集患者及其父母外周靜脈血進行淋巴細胞培養，用常規方法制備染色體，并行G顯帶分析。鏡下計數 20個中期分裂相，并分析5個核型。染色體核型描述參照人類細胞遺傳學國際命名體制2016年的標準[2]進行。

1.2.2 全外顯子組測序 提取患者外周靜脈血基因組DNA，經DNA片段化、末端修復、接頭連接、聚合酶鏈反應等流程制備測序文庫，在NovaSeq 6000高通量測序平臺（美國Illumina公司）上進行雙末端150 bp長度測序，測序深度為100×。測序結果經過濾、質控后與UCSC參考基因組（hg19，2009）進行比對，并采用美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳變異分類標準，結合全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS）數據和疾病相關的拷貝數變異（copy number variation disease，CNVD）數據庫對測序結果進行分析和注釋，確定突變位點對應的基因信息、功能信息及有害性等。拷貝數變異（copy number variation，CNV）結果的判定規則為：0（log2值<-1.1）、1（log2值為-1.1～-0.4）、2（log2值-0.4～0.3）、3（log2值為0.3～0.7）。其中0、1、2、3分別表示0、1、2、3個拷貝（人類中正常為2）。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

本例患者G顯帶的核型為46，XX，del（9）（p23），代表性核型見圖1。其母親的染色體核型為46，XX；父親的染色體核型為46，XY。

圖1 本例患者的染色體核型圖

2.2 全外顯子組測序結果

全外顯子組測序CNV分析結果顯示，本例患者9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區域存在單拷貝缺失，缺失片段長度約為13.0 Mb，該缺失區域覆蓋了61個已知基因，包括DOCK8、FOXD4、KANK1、DMRT等多個與智力發育相關或性發育異常相關的基因。在全外顯子組水平上未發現與臨床表型相關的其他致病性CNV、堿基突變、插入和缺失。見圖2。

圖2 患者各染色體CNV分布圖

2.3 臨床診斷

G顯帶核型分析結果提示本例患者9號染色體短臂末端缺失，經全外顯子組測序分析提示該缺失區域為9p24.3-p23，缺失片段長度約為13.0 Mb，覆蓋了61個已知基因。該缺失區域與9p缺失綜合征的關鍵區域9p22.2-p23有部分重疊，屬于致病性CNV。結合患者臨床表現、超聲及實驗室檢查結果，包括原發性閉經、幼稚子宮、性激素水平異常和癲癇的特征，診斷為9p缺失綜合征。

3 討論

9p缺失綜合征于1973年首次被報道，典型的臨床表現有三角頭畸形、面部異常、智力低下、運動發育遲緩，少數患者可伴有癲癇、先天性心臟病等。男性9p缺失綜合征患者可表現出外生殖器發育異常、性反轉等[3]。本研究采用染色體G顯帶核型分析和全外顯子組測序技術相結合的方法，對1例原發性閉經患者進行分析，結果顯示患者染色體核型為46，XX，del（9）（p23）。采用全外顯子組測序檢測CNV，精確定位了染色體斷裂位置和缺失基因，本例患者在9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區域存在13.0 Mb單拷貝缺失，缺失區域涉及61個已知基因。從臨床表現上看，本例女性9p末端缺失患者除原發性閉經、幼稚子宮、性激素異常、癲癇等癥狀外，并未表現出三角頭畸形、智力語言障礙等9p缺失綜合征典型的臨床癥狀，在國內外尚未見有相似的病例報道。本研究結果為9p缺失綜合征臨床表型異質性提供了新的參考數據。

9p末端缺可遺傳自親代一方平衡易位的染色體，母系、父系遺傳均有報道，也可能由新發染色體突變引起。本研究結果顯示，患者的染色體核型為46，XX，del（9）（p23），其父母的染色體核型均未見異常，表明本例患者是新發的9p末端缺失。既往有研究發現，9p缺失綜合征的關鍵區域為3.5 Mb長度的9p22.2-p23區域[4]。

不同9p缺失綜合征患者的臨床表型變異較大，可能與9p缺失的位置、片段大小或是否合并了其他染色體異常等因素有關[5]。有研究結果顯示，1例男性患兒在9p24.3-p23（271 257～12 048 612）區域存在11.78 Mb單拷貝缺失，缺失區域與本例患者有較多重疊，該例患兒表現出典型的三角頭畸形和智力低下[6]。ONESIMO等[7]報道了1例9pter-p24.1末端小片段缺失的男性患者，主要表現出特殊面容、癲癇、性腺發育不全等。FREDETTE等[8]報道了1例46，XY性腺發育不全患兒，其合并9p24.3-p23缺失和9p23-p21.2重復，體格檢查發現有女性化外生殖器和子宮。AL ACHKAR等[9]報道了1例9p24.2-p22部分三體合并9pter-p24.2部分單體的女性患者，其表現出發育遲緩、特殊面容、原發性閉經等特征。本例患者缺失了9p24.3-p23（24 846～13 022 661）區域，與9p缺失綜合征的關鍵區域9p22.2-p23有部分重疊，該缺失區域為致病性CNV[10]。因此，本例患者的表型也受9p缺失綜合征關鍵缺失區域的影響，從而表現出與既往報道的9p缺失綜合征相似的臨床表現，包括原發性閉經、幼稚子宮、性激素水平異常和癲癇等。然而，本例患者并未表現出三角頭畸形、智力語言障礙等9p缺失綜合征典型的臨床特征，這可能與不同病例之間缺失片段差異有關，也可能與性別因素有關。

盡管染色體顯帶等細胞遺傳學分析為診斷9p缺失綜合征提供了直觀、直接的依據，但臨床對缺失區域的基因型與臨床表型的關聯性和相關機制仍然知之甚少。本研究采用全外顯子組測序技術確定了患者9p24.3-p23缺失區域覆蓋了DMRT1、DMRT3、DMRT2、DOCK8、KANK1、FOXD4等多個與9p缺失綜合征表型密切相關的關鍵基因，且在染色體其他區域并未發現其他致病性CNV、堿基插入和缺失。9p末端9p24.3上的DMRT（DMRTl、DMRT2、DMRT3）是維持男性睪丸分化所必需的基因。男性9p末端缺失可導致DMRT1基因單倍劑量不足，引起男性性反轉[11]。DMRT基因在女性泌尿生殖系統發育中的作用目前尚不明確。有研究結果顯示，DMRT1基因在人類女性胚胎的卵母細胞中有表達，其缺失可能與女性卵巢早衰有關，可引起育齡女性原發性不孕[12-13]。因此，9p24.3-p23缺失導致DMRT1基因單倍劑量不足可能是導致本例患者出現子宮發育不良、原發性閉經、性激素異常的主要原因。同時，DOCK8、FOXD4、KANK1等基因與智力發育相關，DOCK8基因缺失可引起智力低下和癲癇[7]，FOXD4基因缺失可能導致智力低下或語言障礙，而KANK1基因缺失可導致家族性腦癱[14]。因此，DOCK8基因缺失可能是本例患者表現出癲癇的主要原因，但本例患者并未觀察到智力障礙，原因可能是不同患者缺失區域所涉及的DOCK8等智力發育相關基因及其附近多個基因的片段大小不同，對DOCK8基因的表達產生不同的綜合作用，從而導致不同的9p缺失綜合征患者在智力發育方面表現出較大的差異。此外，有研究結果表明，位于9p22.3區域的CERl基因是9p缺失綜合征患者三角頭畸形的關鍵基因[15]。本例患者9p24.3-p23缺失片段并未覆蓋CERl基因，這可能是本例患者未表現出三角頭畸形的原因。本研究結果為揭示CER1基因型和表型的關聯性提供了更多的參考依據。

綜上所述，9p末端缺失導致DMRT1基因單倍劑量不足可能是導致本例患者幼稚子宮、原發性閉經的主要致病因素。本研究為原發性閉經、性發育異常和染色體病的臨床診斷提供了更多線索，進一步揭示了9p缺失綜合征的臨床病理特征。由于9p缺失綜合征較為罕見且具有表型異質性，通過更多病例的收集和分析將有助于明確DMRT1等基因在女性子宮及其他泌尿生殖系統發育中的作用和機制，為該病的診療和遺傳咨詢提供更多的參考依據。