黑米酶解工藝關鍵技術的實驗研究

曲亮璠，郝景雯，謝慶方，黃 華，許勤虎，王祥河

(1. 天津市工業微生物研究所有限公司 天津 300462；2. 天津量信檢驗認證技術有限公司 天津 300462；3. 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司 天津 300462；4. 天津市工業微生物企業重點實驗室 天津 300462；5. 天津市工業微生物工程技術中心 天津 300462)

黑米是我國著名珍貴稻種，資源廣泛，歷史悠久，極具特色。明代李時珍在《本草綱目》中記載，黑米具有“滋陰補腎、健脾暖肝、明目活血”等功效。黑米中蛋白質含量比普通白米高出 25%，VA、VB、VC、鋅、鐵、鈣、磷、銅、錳等維生素和礦物元素也十分豐富[1-2]。除此之外，黑米的皮層中還含有很多高效的功能性物質，如皂苷、生物堿、甾醇、多酚、黃酮、花青素等，能夠起到抗炎、抗過敏、抗氧化、改善微循環、提高機體免疫功能、清除自由基、改變體內酶活性和預防衰老的作用[3-5]。

目前深加工及高附加值谷物產品的開發尚處于起步階段，谷物經糊化、液化、糖化、滅酶、冷卻后添加乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等食用真菌進行單一或復合發酵，再經調配可制備具有創新特色谷物發酵飲料，市場前景良好[6-8]。酶法糖化黑米的反應過程環境友好，副反應少，反應條件較為溫和。辛泓均[9]以葡萄糖當量(DE)為指標優化小米糖化酶解工藝制備小米低醇飲料，得到的最佳酶解參數為酶解溫度50℃、酶解時間 60min、加酶量 184U/g，此時 DE值為 63.3%。李偉等[10]以 DE值為指標，通過正交優化試驗確定了富硒發芽糙米的最適反應條件為酶添加量35μg/mL、酶解反應時長60min、反應溫度85℃。衛曉英等[11]優化了薏米水解工藝，即在溫度 50℃、pH6.0、α-淀粉酶添加量 200U/g條件下水解 3h，還原糖的含量最高為1.73%。

本實驗采用雙酶法對黑米進行了酶解處理，以還原糖為指標優化了黑米糖化工藝，后續可通過生物技術研發谷物類發酵飲料，為黑米的綜合利用及其產品的工業化生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：市售黑米。

試劑：葡萄糖淀粉酶(酶活力≥200000U/g)；α-淀粉酶(酶活力≥20000U/g)；硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

METTLER AE200分析天平；德國米技米技爐；METTLER Seven Multi pH計；上海博迅 GZX-9146MBE數字鼓風干燥箱；上海滬西定時恒溫磁力攪拌器90-2型；力辰恒溫水浴鍋HH-8。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

黑米→清洗→烘干→粉碎→過篩→糊化→糖化→滅酶。

黑米清洗3次后于70℃下烘干、粉碎，過40目細篩，去除大顆粒物。將黑米細粉與蒸餾水按照質量比 1∶15的比例90℃糊化20min，調節溫度和 pH，添加 α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶進行糖化，100℃煮沸3min滅酶。

1.3.2 還原糖含量測定方法

參照 GB 5009.7—2016中直接滴定法測定黑米糖化液中還原糖的含量[12]。

1.3.3 酶解反應單因素實驗

黑米糊化后，分別調節酶制劑添加量(0.2%、0.4% 、0.6% 、0.8%、1.0%)、酶解 pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、葡萄糖淀粉酶與 α-淀粉酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、酶解時間(1、2、3、4h)、酶解溫度(50、55、60、65℃)進行單因素實驗，測定酶解液中還原糖含量，篩選較優反應條件。

1.3.4 酶解工藝正交實驗

在上述單因素實驗結果的基礎上，以酶解液中的還原糖為指標，采用四因素三水平的正交實驗優化酶解工藝，正交因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素與水平設計Tab.1 Orthogonal experimental factors and horizontal design

2 實驗結果

2.1 酶制劑添加量優化

酶制劑添加量對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 1所示。當葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶總添加量從0.2%增加至1.0%時，酶解液中還原糖含量分別為 2.15、3.91、4.06、4.18、4.23g/100g，呈上升趨勢。當酶制劑添加量超過0.6%時，還原糖上升趨勢漸緩，最終接近平衡。此時底物含量成為反應過程中的決定性因素，持續增加酶添加量不能明顯提升酶促反應效果。綜合考慮實驗結果和經濟因素，將反應酶制劑的較適宜添加量定為0.6%。

2.2 酶解時間優化

酶解時間對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 2所示。當葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶的作用時間從 1h延長至 4h，黑米糖化液中的還原糖的含量分別為 2.64、4.08、4.11、4.16g/100g。在反應初始時期，隨著底物與葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶相互作用時間的延長，水解程度不斷提高，酶解持續進行 2h以后目標產物濃度的變化不再明顯。這可能是由于在黑米糖化反應初期體系中淀粉含量較高，底物與酶活性位點可以充分結合；在反應后期隨著液化酶、糖化酶酶活下降，以及受到已生成的葡萄糖底物濃度抑制等因素的影響，黑米糖化液中還原糖的含量不再有明顯的變化[13]。因此，將酶解反應的時間應定為2h。

圖2 酶解時間對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on reducing sugar content in black rice saccharification soluion

2.3 葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶添加比例優化

葡萄糖淀粉酶與 α-淀粉酶添加比例對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖3所示。在黑米的酶解過程中，黑米淀粉受到了內切型 α-淀粉酶和外切型葡萄糖淀粉酶的作用。由于 2種淀粉酶的作用及功能特性并不相同，故二者的添加比例對底物的酶解速度有很大影響。葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，還原糖含量分別為3.43、4.15、4.01、3.65、3.22g/100g。α-淀粉酶為液化酶，可與黑米淀粉分子中的 α-1，4-糖苷鍵隨機結合，并產生同樣數量的還原端和非還原端。葡萄糖淀粉酶為糖化酶，只能與黑米淀粉分子的非還原尾端結合，并對其進行剪切。α-淀粉酶的水解作用可增加葡萄糖淀粉酶底物的摩爾濃度，二者有協同作用。由實驗結果可知，2種淀粉酶水解黑米的較適宜添加比例為 2∶1。

圖3 葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶添加比例對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of glucoamylase and α-amylase addition ratio on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.4 酶解溫度優化

酶解溫度對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 4所示，在 45～65℃范圍內，還原糖含量分別為2.49、3.65、3.93、4.09、3.83g/100g，目標產物的生成量隨著反應體系溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢。在反應過程中，淀粉酶的特殊靶向位點與目標底物相結合。提高反應溫度，酶解速度會逐漸加快，但酶的本質是蛋白質，溫度將改變蛋白質分子的多維空間構象，并影響其結合位點的活性高低。反應溫度過高會導致葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶的穩定性降低，會逐步使酶分子變性，進而影響酶和目標物的有效結合，最終使酶解反應效率下降。因此，黑米酶解的較適宜溫度定為60℃。

圖4 酶解溫度對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.5 酶解pH優化

酶解 pH對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 5 所示，當酶解 pH 分別為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時，酶解液中還原糖的含量分別為 3.19、4.15、3.91、3.88、3.86g/100g，呈現先增大后減小的趨勢。pH 影響酶分子的構象、催化基團中質子供體或質子受體所需的離子化狀態和活性中心上必需基團的解離程度[14]。在糖化過程中需要控制反應體系的 pH 值，使2種淀粉酶活性中心表現出最大催化活力，進而提高酶促反應效率，縮短酶解時長。因此，將黑米糖化反應的初始pH值定為4.0。

圖5 酶解pH對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.6 正交實驗結果

2.6.1 實驗因素與水平

根據上述單因素實驗結果，選取對黑米酶解過程中還原糖含量影響較大的溫度、pH、酶添加量這3個因素，以酶解液中的還原糖含量為指標進行L9(34)的正交實驗。實驗方案及實驗結果見表 2，方差分析結果見表3。

2.6.2 正交實驗結果與分析

由表 2、表 3可知，溫度和 pH因素對黑米糖化反應過程中的還原糖含量有顯著性影響，各因素極差值分別為0.340、0.490、0.194，3個因素對其響應值的影響主次順序為pH〉溫度〉酶添加量。因素A溫度以 A2水平最適，因素 B pH以 B2水平最適，因素 C酶添加量以 C3水平最適。因此，最佳發酵條件為溫度60℃、pH 4.0、酶添加量0.8%。

表2 實驗方案及實驗結果Tab.2 Experimental scheme and experimental results

表3 正交實驗方差分析結果Tab.3 Results of ANOVA of orthogonal experiments

3 結 論

葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶可協同水解黑米中的淀粉進行糖化。通過正交實驗優化了酶解工藝，其中溫度因素、pH因素對黑米糖化過程中的還原糖含量有顯著性影響，得到的最佳條件為酶制劑總添加量0.8%、pH4.0、反應溫度 60℃，此時酶解液中還原糖含量為4.29g/100g。