水族抗痹證藥酒抗類風濕性關節炎的實驗研究

吉楊丹 帥 敏 吳 倩 梁子聰 王 恒 臧貴勇*

1.黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558003；2.黔南州人民醫院，貴州 都勻 558000

類風濕關節炎( rheumatoid arthritis，RA) 是臨床上一種致殘性很高的疾病，其病理表現為滑膜炎性增生、關節軟骨破壞、關節間隙變窄，晚期可出現關節周圍肌肉萎縮及關節僵硬變形[1-3]。中藥治療RA在臨床應用上已有較大的突破，其中雷公藤、祖師麻、青楓藤、白芍等有效成分亦被生產成中藥制劑用于臨床治療[4]。然而挖掘及開發更多中藥、民族藥抗RA制劑也成為目前熱門的課題。本方搜集于三都水族民族地區民間，其被應用治療類風濕關節炎、痛風、骨關節炎已有基礎，而且臨床效果較好。課題組前期已經就該藥酒就急性毒性實驗進行了研究并已發表相關論文。本實驗建立大鼠類風濕關節炎模型，以不同濃度水族抗痹證藥酒方灌胃干預，觀察其是否具有治療RA的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒購自北京誠林生物公司，弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司。顯微鏡 E200型(日本尼康)，酶標儀MR-96A型(深圳邁瑞)等。

1.2 藥酒的制備 由刺五加、雷公藤、黑骨藤、楤木等按一定比例用53度白酒浸泡3個月以上。

1.3 實驗動物與分組 清潔級SD雌性大白鼠50只，體質重(200±20)g，分籠飼養。造模前用數字隨機法將大鼠其分成模型組，空白對照組，抗痹證藥酒高、中、低劑量治療組，每組10 只。

1.4 建模及灌胃 佐劑性關節炎建模[5]取羊毛脂16 g與液體石蠟(72 mL)加溫后置于研缽中，然后將卡介苗等體積滴加入研缽(逐滴加入)，充分研磨均勻后配制成CFA，并分裝至1.5 mL EP管中。除空白組外，其余各組大鼠用75%酒精對大鼠右足趾進行消毒，將CFA 0.15 mL注射于大鼠右足趾皮下，空白組不作任何處理。建模成功后，水族抗痹證藥酒高、中、低劑量組分別給 5 mL/kg、2.5 mL/kg、1.25 mL/kg抗痹證藥酒提取物灌胃，空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天 1次，持續2周。

1.5 指標檢測

1.5.1 大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量測定 造模第14天，末次給藥1 h后，股動脈取血，靜置，離心，取上清液，在-20 ℃下保存待測。白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量采用ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作。

1.5.2 病理組織形態學檢查 取右踝關節組織標本于4%甲醛溶液固定，脫鈣，常規石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡鏡檢觀察。

2 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件進行，計量資料以均數加減標準差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量測定的結果 與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，抗痹證藥酒不同劑量組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，其中高劑量組血清白介素1-β含量，中劑量組和高劑量組血清白介素6含量，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較具有顯著性差異(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的結果比較

3.2 各組大鼠踝關節病理切片觀察結果 正常組(圖1 A)關節滑膜結構層次分明，細胞排列整齊，關節軟骨及骨質未見破壞；模型組(圖1 B)足關節滑膜見明顯充血、水腫，血管翳形成，滑膜可見大量淋巴細胞、漿細胞浸潤，關節軟骨輕度破壞；與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組(圖1 C、圖1 D、圖1 E)大鼠關節滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況相對減輕；與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況以及淋巴細胞、漿細胞等炎細胞浸潤最輕。

4 討論

RA發病機制復雜，炎性介質作用是其發病的主要因素。而白介素-1β、白介素6、腫瘤壞死因子-α是現今發現參與其致炎過程的主要促炎因子之一[2-3，6]。目前在白介素-1家族中有多個成員，其中白介素-1β是通過激活單核-巨噬細胞、B細胞和T細胞參與RA的致炎過程。白介素-1β的主要作用是抑制骨和軟骨的修復，在RA致病過程中是導致骨和軟骨破壞的關鍵細胞因子[7]。研究[8]表明，腫瘤壞死因子-α比白介素-1β更具有致炎作用，高水平的腫瘤壞死因子-α除了參與RA關節破壞和滑膜炎癥外，還與肉芽腫樣滑膜炎產生相關。腫瘤壞死因子-α和白介素-1β兩種細胞因子之間雖然作用不同，但相互調節，抑制糖蛋白和膠原合成，影響軟骨的修復，加快骨質破壞[9]。白介素6由滑膜細胞產生的，是RA關節炎癥中的重要炎癥介質。它雖不直接參與滑膜增生和關節軟骨破壞，但它是腫瘤壞死因子-α和白介素-1β等炎癥因子的效應因子，具有炎癥放大器的作用[10]。

大鼠注射佐劑后，關節可出現紅腫熱痛、功能障礙等炎癥表現，血清炎癥因子增高，關節滑膜增厚，炎細胞浸潤等病理表現，與RA患者的臨床表現十分相似，所以佐劑性關節炎模型是一種公認的類風濕性關節炎模型制作方法[5]。本實驗血清炎癥因子檢測結果顯示，與模型組比較，抗痹證藥酒組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，而高劑量組血清白介素1-β含量、中高劑量組血清白介素6含量和低中高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較，具有顯著性差異(P<0.05)。踝關節鏡下病理觀察可見，與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組(圖1 C、圖1 D、圖1 E)大鼠關節滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況相對減輕；與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況，淋巴細胞、漿細胞浸潤情況最輕。證實抗痹證藥酒不同劑量組均具有佐劑性關節炎大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量的作用，從而減輕關節滑膜炎癥，關節軟骨、骨質破壞。水族抗痹證藥酒在抑制大鼠RA模型炎癥因子方面效果顯著，但其作用機制還有進一步挖掘的價值。本實驗證實了該方具有抗RA的效果，為今后民族方藥開發與利用奠定了理論基礎。