黔東南產續斷多糖提取工藝優化及其抗氧化特性

陳 菊

黔東南民族職業技術學院， 貴州 凱里 556000

續斷，為川續斷科，多年生草本植物，俗稱接骨草、南草、和尚頭等，臨床上常用于肝腎不足、腰膝酸軟、風濕痹痛、跌撲損傷、筋傷骨折、崩漏、胎漏等疾病[1]。貴州是續斷的主產區之一，在其東南部境內，常常生于路旁、溝邊、田埂及撂荒土地等潮濕處。目前對續斷的研究主要是其中的三萜皂苷類、揮發油、生物堿[2-3]等化學成分，續斷中還含有多糖成分,有關利用響應面分析法優化續斷多糖提取工藝及其抗氧化特性方面的研究鮮見報道。因此，本試驗以黔東南產續斷為材料，提取續斷中的多糖，采用響應面法優化其提取工藝，并在體外測定其抗氧化活性，以期為進一步開發和利用續斷資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 續斷采自黔東南州境內，洗凈，烘干；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)、維生素C、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、正丁醇、丙酮，分析純；蒸餾水，實驗室自制。

UV8000S紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；MS204S型電子分析天平(精確度0.0001g)，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)；SYG-6數顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；EV311旋轉蒸發儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；DUG-90764型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 續斷多糖的提取 續斷烘干品，粉粹→粗粉(5 g)，石油醚脫脂2次→以90%乙醇超聲提取2～3次→抽濾，棄去濾液，殘渣加水，水浴提取→活性炭脫色→減壓抽濾→用Sevag法脫蛋白→定容→測吸光度→計算提取率。

1.2.2 續斷多糖提取率的測定 精密稱取無水葡萄糖對照品0.0116 g,置于100 mL量瓶中,加水適量使溶解,稀釋至刻度,搖勻，即得標準溶液(每1 mL中含無水葡萄糖0.116 mg)。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置具塞試管中，并加水補至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻，于水浴中加熱15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水作為空白，在490 nm的波長處測定吸光度[4]。以葡萄糖對照品的質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線并得出回歸方程：A=16.310C-0.075(R2=0.9998)。續斷多糖提取率按(1)式計算

(1)

式中：C為續斷提取液中多糖的質量濃度，mg/mL；V為續斷多糖的定容體積(mL)；N為稀釋倍數；W為樣品的質量，g。

1.2.3 單因素試驗 選取料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1))、提取時間(30、60、90、120、150 min)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)和提取次數(1、2、3、4、5次)為單因素，分別依次按照1.2.1進行續斷多糖提取的單因素試驗。

1.2.4 響應面優化試驗設計 在單因素試驗基礎之上，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用4因素3水平響應面分析法對續斷中多糖的提取條件進行優化，并對優化條件進行驗證。試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素及水平表

1.2.5 續斷多糖抗氧化活性測定 取適量干燥的續斷多糖，配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的續斷多糖水溶液，備用。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參考文獻[5]的方法稍作修改，準確移取2.0 mL 不同濃度的續斷多糖水溶液液于比色管中，加入預先配置好的2.0 mL 2 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其在517 nm 波長處吸光度A，同時測定樣品溶液在 517 nm 處的吸光度A0及DPPH 甲醇溶液在517 nm 處的吸光度A1，每個樣品重復3 次。清除率計算如(2)式所示。

(2)

1.2.5.2 羥基自由基清除能力測定 參考文獻[6]的方法稍作修改，取2.0 mL 不同濃度的續斷多糖溶液，依次加入2.0 mL 6 mmol 硫酸亞鐵、2.0 mL 6 mmol 水楊酸和2.0 mL 6 mmol/mL 雙氧水，混勻后在35 ℃水浴中反應25 min后，在536 nm處測吸光度Ai。以蒸餾水代替雙氧水測定吸光值Aj，空白對照以2.0 mL 蒸餾水代替續斷多糖溶液測定吸光度A0。清除率計算如(3)所示。

(3)

1.2.6 數據統計分析 單因素試驗采用EXCEL、SPSS 22.0進行數據分析，響應面優化試驗采用Design-Expert 8.0.6進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對續斷多糖提取率的影響 如圖1所示，隨著料液比的增加，續斷多糖提取率逐漸增加，當料液比達1∶25時，提取率達最大，繼續增加料液比，提取率反而下降。這是因為液料比較小時，溶劑無法充分浸透，分子擴散速度低，使得提取率較低，隨著液料比的增大，溶劑與續斷細胞間的濃度差增加，增大了多糖從細胞內部向溶劑主體的擴散系數，使提取率增大，當料液比超過1∶25后，繼續增加溶劑，由于溶劑過多，會導致細胞內的其他物質溶出，使提取率下降。因此，最佳料液比選擇1∶25。

2.1.2 提取時間對續斷多糖提取率的影響 如圖2所示，隨著提取時間的延長，續斷多糖提取率逐漸增大，當達最大值90 min時，提取率達最大，繼續延長提取時間，提取率反而下降。其原因可能是提取時間過長，多糖經長時間的高溫浸泡，多糖分子結構被破壞，導致提取率下降。因此，最佳提取時間選擇90 min。

2.1.3 提取溫度對續斷多糖提取率的影響 如圖3所示，提取溫度在60～90 ℃之間，隨著溫度的升高，續斷多糖提取率逐漸增大，當溫度到達 90 ℃ 時，提取率達最大值，繼續升高溫度，提取率反而下降。這可能是溫度過高，會導致多糖開始降解，造成提取率下降。因此，最佳提取溫度選擇90 ℃。

2.1.4 提取次數對續斷多糖提取率的影響 如圖4所示，當提取次數在2～4之間時，續斷多糖提取率變化最為明顯，提取次數在3次時，提取率最大，提取次數超過3次以后，提取率逐漸減少。其原因可能是提取次數增多后提取液逐漸粘稠過濾困難，造成損失，導致提取率下降。因此，最佳提取次數選擇3次。

2.2 響應優化試驗結果與優化分析

2.2.1 回歸模型的建立和顯著性檢測 采用Design-Expert 8.0.6 分析軟件，根據Box-Behnken中心組合試驗原理設計29個試驗，其中4、12、13、22、27 五個試驗為中心試驗，其余試驗為析因試驗，結果如表2所示，續斷多糖提取率Y為響應值。

由表2，可建立(4)式的四元二次回歸方程：

表2 響應面試驗設計及試驗結果

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

(4)

由表3、表4可知，該回歸模型P<0.0001，說明該二次方程模型為高度顯著，而失擬項不顯著(P=0.1532<0.05)，說明方程擬合效果好，CV%=3.29表明試驗的可信度和精確度高。因此，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。通過對回歸方程進行顯著性分析可知，二次項B2與C2達高度顯著，二次項A2、D2及一次項B、D均達極顯著，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD對續斷多糖提取率均不顯著。因此，各因素對續斷多糖提取的影響順序從大到小依次為提取溫度、提取次數、提取時間、料液比。根據四元二次回歸模型，在所選取的各工藝條件范圍內，由軟件分析得到提取續斷多糖的最佳條件為：料液比1∶24.78、提取溫度90.62 ℃、提取時間 91.8 min、提取次數2.62次，此條件下多糖提取率理論上為4.91%。根據實際操作要求，選取最佳提取工藝條件為料液比1∶25、提取溫度91 ℃、提取時間90 min、提取次數3次、試驗重復3次，得到提取率為4.74%，與理論值接近，由此得出該續斷多糖提取工藝條件具有較好的穩定性和可操作性。

表3 回歸模型方差分析

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸模型的可靠性分析

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 清除DPPH自由基(DPPH·)能力測定 續斷多糖清除DPPH自由基能力如圖5所示。在續斷多糖質量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內，隨著續斷多糖質量濃度增加，清除DPPH自由基能力增強。當質量濃度為0.8 mg/mL時，清除能力最強，達到93.9%，相同濃度下VC的清除率為105.9%，說明續斷多糖具有較強的清除DPPH自由基能力。

2.3.2 清除羥基自由基(·OH)能力測定 續斷多糖清除羥基自由基能力如圖6所示。在續斷多糖質量濃度0.2～1.2 mg/mL范圍內，隨著續斷多糖質量濃度增加，清除羥基自由基能力增強。當質量濃度為0.6 mg/mL時，清除能力最強為68%，說明續斷多糖具有較強的清除羥基自由基能力。

3 討論

張丹等[7]運用正交試驗設計提取渝產續斷中的多糖，結果表明在料液比為1∶20(g·mL-1),提取時間60 min，提取4次的最佳工藝條件下，續斷多糖的平均提取率為7.47%，但并沒有將試驗中的各因素與指標的相互關系進行擬合，建立數學模型。本研究在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析法，得出影響續斷多糖提取的因素順序為提取溫度﹥提取次數﹥提取時間﹥料液比，并建立提取續斷多糖的回歸模型方程為：

Y=4.87-0.071A+0.14B+0.093C-0.17D+0.052AB-0.012AC-0.12AD-0.047BC-0.1BD+0.11CD-0.26A2-0.14B2-0.47C2-0.22D2

通過對提取工藝中的參數進行優化得到最佳提取條件為：料液比1∶25( g·mL-1)、提取溫度91 ℃、提取時間90 min、提取3次，在該條件下續斷多糖提取率為4.74%。此法比正交試驗設計直觀，試驗精度高，還提高了試驗的預測性，具有較好的實用價值。

DPPH自由基是一種穩定的有機自由基，對DPPH自由基的清除率可以作為評價物質抗氧化活性的指標之一[8]。羥基自由基毒性極強，可對生物膜造成損傷，導致多種疾病發生，清除體內羥基自由基是確保機體健康必不可少的需求[9]。將本試驗中最佳提取條件下的多糖提取液進行抗氧化試驗，發現其具有較強的清除DPPH自由基、羥基自由基的能力，說明續斷具有良好的體外抗氧化活性。因此，該研究為續斷資源在抗氧活性方面的研究提供理論參考依據。