Cav-1表達對非小細胞肺癌患者吉非替尼治療敏感性的影響

高冬梅，宋雪晶，安 杰，王永欣，范 婧，劉靜普

2021年國家癌癥中心發布最新全國癌癥統計數據結果表明，2020年肺癌的發病率及病死率均占第一位，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%左右。近年來隨著分子靶向治療逐步應用于臨床，使得具有敏感基因突變的晚期NSCLC生存期有了明顯改善。分子靶向治療已經成為具有敏感基因突變NSCLC患者的主要治療手段。目前研究表明，針對表皮生長因子受體(EGFR)突變陽性的NSCLC，應用分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)治療均較傳統化療顯著延長了無進展生存期(PFS)和總生存期[1-6]，EGFR-TKIs已經成為國際上公認的EGFR敏感突變陽性NSCLC一線治療方案。EGFR-TKIs耐藥問題已成為目前分子靶向治療過程中亟待解決的問題，其耐藥機制仍未完全明確。小凹蛋白-1(Cav-1)是細胞膜上Caveolae的重要組成蛋白，其通過與EGFR結合參與細胞增殖、分化過程[7-9]。已有研究表明，腫瘤細胞對EGFR-TKIs治療的敏感性不同，其Cav-1的表達也不同[10]。因此，推測Cav-1表達與腫瘤細胞對EGFR-TKIs耐藥相關。本研究通過免疫組織化學法檢測具有EGFR敏感突變的NSCLC患者吉非替尼耐藥前后肺癌組織中Cav-1表達情況，利用具有EGFR敏感突變NSCLC細胞株PC-9，采用Western blot法驗證Cav-1過表達的穩定轉染細胞株，采用劃痕修復實驗檢測吉非替尼對穩定轉染細胞株遷移的影響，并采用Western blot法檢測不同Cav-1表達情況下EGFR、ERK及AKT激酶磷酸化水平，從而探討Cav-1表達與NSCLC對吉非替尼耐藥機制之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗材料及試劑 所有標本為我院病理科2012—2019年組織穿刺標本(肺組織或轉移淋巴結組織)，經基因檢測證明具有EGFR敏感突變確診為ⅢB期或Ⅳ期肺腺癌21例。均應用吉非替尼治療獲益，其中男9例，女12例；中位發病年齡66歲；療效評價穩定7例，部分緩解14例。中位耐藥時間10.3個月，無疾病進展時間：最短為4個月，最長為23個月；同時收集耐藥后腫瘤組織穿刺標本。所有組織切片均經兩名有經驗的病理醫師雙盲重新閱片，確診為肺腺癌，應用免疫組織化學法進行Cav-1表達水平檢測。EGFR敏感突變的NSCLC細胞株PC-9(哥倫比亞大學)，PC-9/Cav-1細胞和PC-9/pcDNA3.1細胞(本實驗室培養)，胎牛血清(Hyclone)，吉非替尼(AstraZeneca)；兔抗EGF Receptor單克隆抗體，兔抗p-ERK 1/2多克隆抗體、兔抗p-AKT多克隆抗體(Cell Signaling)；兔抗Cav-1抗體、鼠抗Cav-1單克隆抗體、鼠抗β-actin抗體(Santa Cruz)；鼠抗磷酸化酪氨酸單克隆抗體(Millipore)；酶標儀、低溫離心機(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1資料收集：收集應用吉非替尼耐藥病例，記錄其用藥時間與疾病進展時間，計算PFS，統計PFS>9.5個月和≤9.5個月病例數。

1.2.2免疫組織化學法檢測：將NSCLC患者吉非替尼治療耐藥前后的組織切片，厚度3～5 μm；脫蠟至水；3%H2O2滅活內源性過氧化物酶(10 min)；EDTA高溫、高壓抗原修復；滴加鼠抗人Cav-1單克隆抗體(1∶200)；放入4 ℃冰箱過夜；滴加二抗，DAB顯色，蘇木素顯色，蓋玻片封片。用已知Cav-1表達陰性的正常肺組織作為陰性對照，用已知Cav-1表達陽性的肺癌組織作為陽性對照。光鏡下可見Cav-1在間質和細胞膜著色。著色陽性表現為棕黃色或棕色，隨機選取觀察視野，計算陽性腫瘤細胞比例。陽性細胞數>25%定義為陽性，反之為陰性。

1.2.3細胞培養：將細胞凍存管從液氮中取出復蘇，放入恒溫培養箱中繼續培養。

1.2.4Western blot檢測Cav-1蛋白水平：處于對數生長期的PC-9、PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞消化后，提取蛋白，酶標儀檢測蛋白水平。將30 μg蛋白樣本等體積上樣，電泳、轉膜、封閉，分別置于兔抗Cav-1抗體(1∶4000)、鼠抗β-actin抗體(1∶5000)中，孵育過夜。洗滌，ECL顯色，在暗室曝光。用掃描儀掃描膠片，實驗重復3次。

1.2.5MTT法檢測細胞增殖能力：將對數生長期的PC-9/Cav-1及PC-9/pcDNA3.1穩定轉染細胞株，等濃度接種于96孔板，空白液為調0孔，均設3個復孔。培養24 h，加入含有不同濃度吉非替尼(0～2.56 μmol/L)的培養液繼續培養48 h。每孔加入MTS溶液20 μl，培養30 min。檢測吸光度值(波長490 nm)。計算細胞生長抑制率，觀察吉非替尼半數抑制濃度(IC50)。實驗重復3次。

1.2.6劃痕修復實驗檢測細胞遷移能力：穩定轉染細胞株PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1接種于24孔板，均設復孔。培養24 h后，垂直于孔底劃直線，用含或不含0.015 μmol/L吉非替尼的完全1640培養液繼續培養18 h，每6小時拍照1次，計算遷移率。實驗重復3次。

1.2.7Transwell法檢測細胞侵襲能力：基質膠鋪在小室底部，PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞饑餓4 h。上室加入無胎牛血清、下室加入含10%胎牛血清的1640培養基。分別用2 ml無胎牛血清1640培養基及含0.015 μmol/L吉非替尼的1640培養基重懸細胞，將等量的細胞加入上室，培養24 h。取出小室，常規HE染色，在200倍光鏡下拍照，選取5個視野，計算穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.2.8Western blot檢測信號通路蛋白磷酸化水平：將PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞消化分為兩組接種在35 mm培養皿，培養24 h后，PBS洗滌，加入濃度為0.04 μmol/L吉非替尼培養液，一組直接收集細胞，另一組培養4 h收集細胞，Western blot檢測相應蛋白的表達情況。實驗重復3次。

2 結果

2.1不同PFS患者癌組織Cav-1陽性率比較 本組PFS≤9.5個月9例，>9.5個月12例。PFS≤9.5個月患者癌組織Cav-1表達均為陽性；而>9.5個月患者Cav-1表達陽性7例(58.3%)；PFS≤9.5個月患者癌組織Cav-1表達陽性率高于>9.5個月患者(P<0.05)。

2.2不同PC-9細胞Cav-1蛋白表達水平比較 通過Western blot檢測，PC-9/Cav-1細胞Cav-1蛋白相對表達水平較PC-9/pcDNA3.1細胞明顯增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同PC-9細胞Cav-1蛋白表達情況Cav-1為小凹蛋白-1；與PC-9/pcDNA3.1細胞比較，①P<0.05

2.3Cav-1對不同濃度吉非替尼處理PC-9細胞增殖能力的影響 PC-9/Cav-1細胞的生長抑制率較PC-9/pcDNA3.1細胞降低，PC-9/Cav-1細胞吉非替尼的IC50值為0.04±0.01明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞的0.015±0.01(P<0.05)。見圖2。

圖2 Cav-1對不同濃度吉非替尼處理PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞抑制率的影響Cav-1為小凹蛋白-1

2.4Cav-1對PC-9細胞遷移能力的影響 無吉非替尼培養基培養6、12、18 h，PC-9/Cav-1細胞遷移率分別為(20.10±0.01)%、(26.64±0.01)%、(50.00±0.00)%，PC-9/pcDNA3.1細胞遷移率分別為(14.89±0.02)%、(22.44±0.01)%、(25.08±0.02)%，PC-9/Cav-1細胞遷移率分別高于PC-9/pcDNA3.1細胞(P<0.05)。含0.015 μmol/L吉非替尼培養基培養6、12、18 h，PC-9/Cav-1細胞遷移率分別為(15.25±0.00)%、(20.44±0.02)%、(22.47±0.01)%，PC-9/pcDNA3.1細胞遷移率分別為(5.61±0.01)%、(9.90±0.02)%、(12.10±0.00)%，PC-9/Cav-1細胞遷移率分別高于PC-9/pcDNA3.1細胞(P<0.05)。見圖3。

圖3 Cav-1對PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞遷移能力的影響(10×)Cav-1為小凹蛋白-1

2.5Cav-1對PC-9細胞侵襲能力的影響 Transwell法檢測顯示，PC-9/Cav-1細胞在無吉非替尼作用下穿膜細胞數為(93.00±11.68)個，多于PC-9/pcDNA3.1細胞的(66.40±6.02)個(P<0.01)；PC-9/Cav-1細胞在0.015 μmol/L吉非替尼作用下穿膜細胞數為(56.20±4.87)個，多于PC-9/pcDNA3.1細胞的(23.20±3.19)個(P<0.01)。見圖4。

圖4 Cav-1對PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞侵襲能力的影響(HE×200)Cav-1為小凹蛋白-1

2.6吉非替尼對PC-9細胞信號通路蛋白磷酸化水平的影響 無或有吉非替尼培養基培養的PC-9/Cav-1細胞pY-EGFR、p-ERK、p-AKT表達水平均明顯高于PC-9/pcDNA3.1細胞(P<0.01)。見圖5。

圖5 有或無吉非替尼培養基培養的PC-9/Cav-1和PC-9/pcDNA3.1細胞信號通路蛋白磷酸化水平的影響EGFR為表皮生長因子受體，Cav-1為小凹蛋白-1

3 討論

針對晚期NSCLC，化療已進入瓶頸期，雖然化療藥物不斷更新，在療效上也有所改善，但是中位PFS為6個月左右，1、2年生存率分別為30%、10%左右[10-11]。隨著對肺癌發病機制研究的逐步深入，針對基因敏感突變晚期NSCLC的靶向藥物逐步應用于臨床，取得了良好療效。IPASS研究發現，EGFR突變作為目前已知肺癌驅動基因，其突變率為19%～48%[12]。有研究證實，EGFR-TKIs客觀緩解率為60%～85%，PFS為8～13個月[13-16]，奠定了EGFR-TKIs在EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC一線治療中的地位。FLAURA與ADAURA試驗分別奠定了三代EGFR-TKIs在EGFR敏感突變陽性晚期NSCLC一線治療及術后輔助治療中的地位。然而，部分具有EGFR敏感突變患者仍存在EGFR-TKIs效果不佳、治療敏感性不一的情況，本研究認為與患者同時存在其他蛋白間相互作用信號通路激活，導致腫瘤細胞增殖有關。

Cav-1為膜整合蛋白，N端氨基酸殘基為Cav-1的功能區，該區域與EGFR結合參與細胞代謝過程[7,9]。70%以上NSCLC患者的腫瘤細胞均有Cav-1表達，Cav-1高表達NSCLC患者的腫瘤細胞增殖及潛在轉移能力增強[17]。MEIER等[18]通過破壞caveolae從而成功阻止PI3K的活化，并證明Cav-1通過影響EGFR信號通路蛋白磷酸化或去磷酸化等途徑調控信號傳導改變腫瘤細胞的多種生物學行為[8]，參與PI3K/AKT信號通路激酶系統的信號傳導，促進腫瘤細胞增殖，抑制凋亡，導致腫瘤發生[17]。作為細胞膜的重要組成蛋白，在肺癌化療、放療耐藥后均存在Cav-1表達增加[19]，在紫杉醇耐藥的肺腺癌A549細胞中，敲低Cav-1能夠抑制AKT的磷酸化，而降低細胞增殖能力[8]。將肺癌H292細胞暴露于NO中會引起Cav-1、p-AKT過表達，導致肺癌H292細胞對阿霉素和依托泊苷耐藥，促進細胞存活[20]。另有研究表明，Cav-1過表達導致A549和PC-9細胞對鉑類耐藥，抑制Cav-1/AKT/Bad信號通路，恢復耐藥A549和PC-9細胞株對順鉑的敏感性[21]。PHILIPS等[22]通過雷公藤甲素處理A549和H460 NSCLC細胞，發現其能夠降低Cav-1表達，并通過AKT/Bax通路影響肺癌細胞。上述研究均說明Cav-1參與腫瘤信號傳導通路的激活，并與腫瘤的放化療耐藥相關。本研究結果發現，在EGFR敏感突變NSCLC患者癌組織中Cav-1表達水平與療效相關，在吉非替尼治療過程中，疾病進展較快的EGFR敏感突變NSCLC患者，Cav-1表達水平高于PFS較長患者。同時本研究還發現，Cav-1過表達的EGFR敏感突變PC-9細胞在吉非替尼作用下較Cav-1正常表達PC-9細胞的遷移能力增強。Cav-1過表達導致EGFR敏感突變PC-9細胞EGFR和AKT磷酸化程度增強，EGFR下游PI3K/AKT信號傳導增強，促進細胞生長遷移，減弱了吉非替尼對下游PI3K/AKT信號傳導通路的抑制作用，導致EGFR敏感突變PC-9細胞對吉非替尼的敏感性降低，由此表明Cav-1高表達與具有EGFR敏感突變NSCLC患者EGFR-TKIs治療耐藥相關。

綜上所述，對于EGFR敏感突變NSCLC患者，若同時存在Cav-1高表達，則應用吉非替尼治療的PFS較Cav-1低表達患者短。Cav-1過表達使EGFR敏感突變PC-9細胞對吉非替尼耐受性增加，細胞的遷移能力增強。Cav-1參與了EGFR磷酸化過程，同時也促進了下游PI3K/AKT、MAPK/ERK信號傳導通路蛋白磷酸化過程，促進信號傳導。在Cav-1過表達的PC-9細胞中，吉非替尼對上述信號傳導過程的抑制作用減弱，進而導致腫瘤細胞對吉非替尼治療敏感性下降。但由于本研究樣本量較小，該結論有待大樣本研究結果進一步證實。