長鏈非編碼RNA LINC00467在卵巢癌的表達及其臨床意義

李劍琦 生秀杰

廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦科，廣東省產科重大疾病重點實驗室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點實驗室（廣州 510150）

長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類由長度大于200個核苷酸組成的RNA分子，其中大多數(shù)不翻譯成蛋白質，而是以RNA 的形式發(fā)揮各種生物學功能［1］。近年來，越來越多的研究［2-5］提示，LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達，并參與調控多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的信號通路，從而改變腫瘤細胞的生物學行為，包括細胞分化、增殖、凋亡、自噬、侵襲和遷移等等。大量研究［6-9］表明，LncRNA 在卵巢癌的發(fā)生、生長、代謝、侵襲、轉移、耐藥等多個生物學過程中均發(fā)揮著重要作用。本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，5-氮雜-2-脫氧胞苷可以逆轉MEG3基因的甲基化從而增加LncRNA-MEG3 的表達，LncRNA-MEG3 通過調控P53 和Rb1 起到抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖和促進凋亡的作用［10-11］。

LINC00467 是一種最近鑒定出的長鏈非編碼RNA，既往研究［12-19］表明，其在結腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、膠質瘤、骨肉瘤以及頭頸部鱗癌等腫瘤中的表達均會出現(xiàn)失調，從而發(fā)揮出不同的腫瘤生物學效應。例如，在結腸癌中，LINC00467的表達量是升高的，通過靶向細胞周期（Cyclin D1、Cyclin A1、CDK2、CDK4 等）以及上皮間質轉化（Ecadherin、N-cadherin）相關蛋白，從而發(fā)揮出癌基因的作用［14］。近年來越來越多的證據(jù)［20］表明，LncRNA可以作為競爭性內源RNA 在多種腫瘤細胞中發(fā)揮出癌基因或者抑癌基因的作用。既往研究［21］已經證實，LncRNA中富含微小RNA（micro RNA，miRNA）反應元件（MRE），并且可以充當miRNA 海綿。LncRNA 能夠通過海綿化miRNA，將其從下游靶基因mRNA 的結合位點釋放，從而調節(jié)靶基因的表達。前期的研究中，通過生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)LINC00467 中包含miR-302a-3p 的結合位點。

本研究初步探討卵巢癌LINC00467 的表達情況及其與卵巢癌的臨床病理特征的關系，并進一步探究其在卵巢癌細胞的生物學特性及其可能的作用機制，探討LINC00467 是否可能通過調控miR-302a-3p 而起到抑癌基因的作用，為尋找卵巢癌的早期診斷的標志物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系和卵巢癌組織的獲取6 種卵巢癌細胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人正常卵巢上皮細胞系（HOSEpiC）購自中國科學院細胞庫（中國上海）。所有細胞均使用Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）（Corning，Inc.）在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10% 胎牛血清（FBS，Corning，Inc.）和1%青霉素-鏈霉素。廣州醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院2014-2016年共收集了66 例卵巢癌組織（OC，設為卵巢癌組織組）及66 例因良性病變行切除的正常卵巢組織（設為正常組織組），根據(jù)卵巢癌組織中LINC00467 的表達情況從高到低排序，前33例設為高表達組（n=33），后33 例設為低表達組（n=33）；上述卵巢癌組織和正常卵巢組織的收集經過患者知情同意后獲取，知情同意符合赫爾辛基宣言。本研究經廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院倫理委員會審查批準。

1.2 細胞轉染LINC00467 短發(fā)夾RNA（shRNA）（sh-LINC00467）、陰性對照shRNA（sh-NC）設計、miR-302a-5p mimics 和miR-302a-5p inhibitor 及其陰性對照（miR-mimics NC、miR-inihibitor NC）設計從廣州銳博生物技術有限公司購買。在處理前1 d將4 × 105細胞接種到60 mm 平板中。在操作當天，根據(jù)說明書建議的量將20 nmol/L 轉染溶液與HiPerFect 和無血清培養(yǎng)基混合，以產生最終體積100 μL 的轉染試劑混合物。將混合物溶液孵育15 min 形成轉染復合物。將100 μL 的溶液逐滴滴入細胞中，并將混合物置于培養(yǎng)箱中，使用Lipofectamine 3000 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）在37 ℃下按照制造商說明將上述試劑轉染到細胞中。轉染后48 h 收集細胞以備進一步使用。轉染基因序列如下：sh-LINC00467#1，5′-CCG GGG TTT AAT AGA CAT GGA TAC TCG AGT ATC CAT GTC TAT TAA ACC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG GTT TAA TAG ACA TGG ATA CTC GAG TAT CCA TGT CTA TTA AAC C-3′；sh-LINC00467#2，5′-CCG GGA AGA AGA GAA GAG AGA AAC TCG AGT TTC TCT CTT CTC TTC TTC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG AAG AAG AGA AGA GAG AAA CTC GAG TTT CTC TCT TCT CTT CTT C-3′；sh-NC，5′-CCG GCA ACA AGA TGA AGA GCA CCA ACT CGA GTT GGT GCT CTT CAT CTT GTT GTT TTT G-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACC AAC AAG ATG AAG AGC ACC AAC TCG AGT TGG TGC TCT TCA TCT TGT TG-3；miR-302a-5p mimics，5′-UAA GUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3′；miR-mimics NC，5′-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3′；miR-302a-5p inhibitor，5′-AUU CAC GAA GGU ACA AAA CCA CU-3′；miRinihibitor NC，5′-CGA ACG UGU CAC GUT T-3′。

1.3 CCK-8 實驗和集落形成實驗使用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8，Dojindo日本）和集落形成試驗評估細胞增殖能力。將OVCAR-3 和SKOV3 細胞接種在96 孔板中（每孔2×103個細胞）。將細胞在37 ℃下培養(yǎng)24、48 和72 h，將CCK-8 溶液（10 μL）添加到96孔板的培養(yǎng)基中。然后將混合物在37 ℃孵育1.5 h，并使用分光光度計（BioTek Instruments，Inc，美國）測量450 nm 處的吸光度（OD）。對于集落形成實驗，將轉染的細胞接種到6 孔板中，并在37 ℃和5%CO2下孵育14 d。隨后，細胞集落在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定，并在室溫下用0.1% 結晶紫（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）染色30 min。在顯微鏡（Leica Microsystems，德國）下計數(shù)菌落數(shù)。

1.4 Transwell 遷移和侵襲測定對于細胞遷移，細胞轉染后，消化細胞，將OVCAR-3 和SKOV3 細胞重新懸浮在不含F(xiàn)BS 的DMEM 中，取細胞懸液100 μL 加入Transwell 小室，將小室架在24 孔板上，在24 孔板下室一般加入600 μL 的培養(yǎng)基。對于細胞侵襲測定，將OVCAR-3 和SKOV3 細胞重懸于不含F(xiàn)BS 的DMEM 中，隨后加入覆蓋有Matrigel（Corning Inc.）的上室。在這兩種測定中，24 孔板的下腔室充滿了含有10%FBS 的DMEM。在37 ℃下孵育36 h 后，將Transwell 插入物用PBS 洗滌3 次，用甲醇固定，并在室溫下用結晶紫（Sigma-Aldrich，美國）染色30 min。在光學顯微鏡（Nikon，Tokyo，Japan）下計數(shù)侵襲細胞的數(shù)量。

1.5 定量實時PCR（qPCR）檢測使用Trizol 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.美國）從冷凍的OC 組織、正常卵巢組織和卵巢癌細胞系中提取總RNA，并使用Revert Aid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，Inc.美國）逆轉錄為互補DNA。使用SYBR Premix Ex Taq II Kit（TaKaRa，中國）進行qPCR 檢測，測定LINC00467和miR-302a-3p 的表達水平。熱循環(huán)程序包括在94 ℃下保持2 min，然后在94 ℃下30 s、56 ℃下30 s和72 ℃下60 s進行30個循環(huán)。在本研究中，GAPDH用作內源性對照。使用2-ΔΔCq方法計算相對mRNA表達。每個樣品一式三份進行分析，LINC00467 引物Forward 5′-GCG TAG GCC GGA CAT TTC TA，Reverse 5′-CCT GCC ATG TTG GAA ACT GC；miR-302a-3p 引物Forward 5′- TAA GTG CTT CCA TGT TT，Reverse 5′-TGG TGT CGT GGA GTC G；GAPDH引物Forward 5′-GCA ACT AGG ATG GTG TGG CT，Reverse 5′-TCC CAT TCC CCA GCT CTC ATA。

1.6 雙熒光素酶報告基因測定將含有全結合序列的LINC00467 和含有野生型（wt）和突變型（mut）miR-302a-3p 分別克隆到Promega 公司提供的psi-CHECK2 載體中，以生成wt 或mut 質粒，然后，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）轉染到OVCAR-3 和SKOV3 細胞。在穩(wěn)定轉染36 h 后，根據(jù)制造商的說明書步驟進行雙熒光素酶報告基因檢測（Promega 公司）以檢測相對熒光素酶信號。在分析之前，首先將熒光素酶的活性標準化為來自相同細胞的海腎熒光素酶的活性。

1.7 生物信息學分析利用基于癌癥基因組圖譜（TCGA）的基因表達譜交互分析數(shù)據(jù)庫（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/）評估LINC00467 在OC中的表達水平；通過Starbase 數(shù)據(jù)庫（https：//starbase.sysu.edu.cn）評估LINC00467 與miR-302a-3p 的結合位點。

1.8 統(tǒng)計學方法使用SPSS 17.0軟件（SPSS，Inc.）和GraphPad Prism 9.0軟件（GraphPad Software，Inc.）進行統(tǒng)計，計量資料使用均值±標準差表示，使用Student′st檢驗分析；計數(shù)資料比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson 相關性分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC00467 在卵巢癌組織（OC）和卵巢癌細胞系中表達上調從GEPIA 下載的表達譜結果提示卵巢癌組織（OC）LINC00467 表達明顯高于對照組（圖1A）。進一步采用qPCR 檢測66 例OC 組織及其66例正常卵巢組織中的LINC00467表達情況，與66 例正常卵巢組織相比，OC 組織中LINC00467的表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1B）。LINC00467 表達與臨床特征（包括組織學類型、病理分級、淋巴結轉移和FIGO 分期）的關系見表1，結果顯示LINC00467 高表達組和低表達組病理分級、淋巴結轉移和FIGO 分期差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。卵巢癌患者總生存期的分析結果表明低表達LINC00467 的OC 患者總生存期優(yōu)于高表達LINC00467 的OC 患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1C）。此外，本研究檢測了6 種卵巢癌細胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人卵巢上皮細胞系（HOSEpiC）中LINC00467的表達水平，卵巢癌細胞系的LINC00467表達水平顯著高于人卵巢上皮細胞系（圖1D）。由于在OC 細胞系中OVCAR-3 和SKOV3 兩株細胞系LINC00467 表達水平最高，因此將這兩株細胞系用于下一步研究。

圖1 卵巢癌TCGA 隊列中、卵巢癌組織和正常卵巢組織、卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞LINC00467A 表達水平Fig.1 LINC00467 is upregulated in OC tissue samples and cell lines，and TCGA

2.2 沉默LINC00467 抑制OVCAR-3 和SKOV3細胞系的增殖、遷移和侵襲能力通過轉染sh-LINC00467#1 和sh-LINC00467#2 使OVCAR-3 和SKOV3細胞系中的LINC00467沉默。與sh-NC組對比，sh-LINC00467 轉染OVCAR-3 和SKOV3 兩種細胞系后LINC00467 的表達均顯著下調（圖2A）。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，與sh-NC組對比，sh-LINC00467組OVCAR-3 和SKOV3 細胞的增殖能力逐漸降低（圖2B）。再次，sh-LINC00467 轉染的OVCAR-3 和SKOV3 細胞中，集落形成試驗提示集落數(shù)量顯著減少（圖2C）。同時，Transwell 檢測發(fā)現(xiàn)，與sh-NC 組比較，sh-LINC00467 組的OVCAR-3 和SKOV3 細胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制（圖2D-E）。

圖2 沉默LINC00467 后可顯著抑制卵巢癌細胞惡性生物學表型Fig.2 Inhibition of LINC00467 suppresses the abilities of proliferation，migration，and invasion in OC OVCAR-3 and SKOV3 cell lines

2.3 LINC00467 可能通過調控miR-302a-3p 發(fā)揮促癌作用進一步通過生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)，LINC00467中包含miR-302a-3p的結合位點（圖3A）。通過qPCR 檢測66 例OC 組織及其66 例正常卵巢組織中的miR-302a-3p 表達情況，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-302a-3p的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3B），與LINC00467 表達恰好相反，兩者呈現(xiàn)出顯著的負相關關系（R2=0.381 5，P＜0.01，圖3C）。進一步通過熒光素酶報告實驗驗證了LINC00467 與miR-302a-3p 之間的直接結合關系（圖3A）。同時，發(fā)現(xiàn)OVCAR-3 和SKOV3 兩種卵巢癌細胞系中敲低LINC00467 后，可以顯著升高miR-302a-3p 的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3D）。

圖3 LINC00467 靶向調控miR-302a-3pFig.3 LINC00467 targets miR-302a-3p in OC cells

3 討論

卵巢癌是女性腫瘤中第七大常見的腫瘤，僅次于宮頸癌，每年約有152 000 死亡病例，給全球女性的健康造成了嚴重的威脅［22］。在過去30年中，得益于腫瘤的治療手段和篩查方法的飛速發(fā)展，腫瘤的五年生存率總體上提高了20%，乳腺癌的五年生存率可達85%左右［23］。然而，卵巢癌的診治水平進步有限，即使在歐美等醫(yī)療資源相對豐富的國家，幾十年來卵巢癌五年生存率僅僅維持在47%的水平［24］。手術切除是卵巢癌唯一治愈性治療的手段，其治療效果依賴于分期和組織學類型［25-26］。據(jù)既往研究，早期卵巢癌，即使伴有侵襲性組織亞型，其手術切除治愈率可高達90%［25］。但絕大多數(shù)卵巢癌患者在疾病的進展期才被診斷，失去了進行治愈性手術切除的機會，導致卵巢癌的病死率與發(fā)病率之比超過0.6；尤其是進展到Ⅲ/Ⅳ期才被診斷的卵巢癌，其病死率甚至超過75%。對于進展期卵巢癌的治療，目前的治療仍是基于鉑類或紫杉醇的聯(lián)合治療［27］。這些治療方案的使用顯著改善了進展期卵巢癌患者的預后。上皮性卵巢癌患者對初始化療反應非常好，大約80%的患者對此有很好的反應，但是長期的隨訪結果提示其中許多患者都會復發(fā)［26］。因此，深入探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，發(fā)現(xiàn)更加有效的早期診斷及精準治療靶點，對于卵巢癌早篩和治療都具有十分重要的意義。

目前已經有越來越多的研究表明，LncRNA 在卵巢癌的發(fā)生、增殖、代謝、侵襲、轉移、耐藥等多個生物學過程中均發(fā)揮著重要作用［6-9］。LIANG等［6］發(fā)現(xiàn)，LncRNA-PTAF 可以調控miR-25/SNAI2信號軸促進卵巢癌發(fā)生EMT 和轉移。?ZES 等［28］研究表明，高表達LncRNA HOTAIR 能夠提示順鉑耐藥的發(fā)生，這樣的患者接受順鉑后發(fā)生死亡的風險比低表達的病人高0.63～2.64 倍，但這種表達的差異對于未接受順鉑治療患者的死亡風險并無明顯影響。

本研究結果提示LINC00467在卵巢癌組織和卵巢癌細胞系中均表達上調，并進一步發(fā)現(xiàn)LINC00467高表達與卵巢癌患者的五年生存率等不良預后有明顯關系。通過細胞生物學研究進一步發(fā)現(xiàn)LINC00467可以促進卵巢癌細胞發(fā)生增殖和促進卵巢癌細胞發(fā)生侵襲和轉移，提示LINC00467 在卵巢癌中可能扮演一個癌基因的角色；揭示LINC00467可作為卵巢癌治療的一個潛在靶點，因此本研究對其具體調控機制進行了進一步探討。

目前已知的研究中，比如在原發(fā)性肝癌中，LINC00467 的表達量降低，其通過miR-9-5p/PPARA 信號軸發(fā)揮抑制肝癌增殖、侵襲、遷移等惡性生物學表型作用［29］。ZHANG 等［19］發(fā)現(xiàn)LINC00467可能通過抑制P53 的表達而達到促進腦膜瘤的進展。李思瑩等［30］發(fā)現(xiàn)LINC00467 可能通過靶向調控miR-495-3p 而抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖和凋亡。因此，LncRNA 能夠通過海綿化miRNA，將其從下游靶基因mRNA 的結合位點釋放，從而調節(jié)靶基因的表達。在前期的研究中通過生物信息學分析預測，發(fā)現(xiàn)LINC00467 中包含miR-302a-3p 的結合位點。進一步的研究發(fā)現(xiàn)LINC00467 與miR-302a-3p 的表達量呈現(xiàn)出負相關關系，也通過通過熒光素酶報告實驗驗證了LINC00467 與miR-302a-3p 之間的直接結合關系，敲低LINC00467 可以顯著升高miR-302a-3p的表達水平，上述結果都驗證了筆者的推測，在卵巢癌中高表達的LINC00467可能通過miR-302a-3p 發(fā)揮促癌基因的作用。

為了進一步探討LINC00467 和miR-302a-3p 之間的關系，明確上下游作用，需要在后續(xù)的深入研究中使用RNA 結合蛋白免疫沉淀明確LINC00467對miR-302a-3p 的直接調控機制，并探討下游的可能的mRNA，明確LINC00467 通過哪個信號軸調控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。