帶血管骨髓移植加速部分清髓受體的造血系統重建

王玉芝 吳燕虹 張斌 唐建兵 程飚 陳建武

南部戰區總醫院燒傷整形科（廣州 510010）

骨髓移植應用廣泛，而骨髓微環境對移植骨髓細胞功能的發揮至關重要，它由不同的基質細胞組成，包括內皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞和成骨細胞等。大量研究證實，骨髓細胞聯合成骨細胞、間充質干細胞甚至去骨髓的骨瓣等均可促進骨髓植入，有利于清髓受體的造血重建及耐受誘導。同時，基質細胞和骨髓細胞間存在MHC 限制性，即二者MHC相容才有利于骨髓植入［1-2］。而帶血管的骨髓移植（vascularized bone marrow transplantation，VBMT）是將含血供的骨組織通過顯微血管吻合的方式移植給受體，在不破壞骨髓天然的物理環境的情況下同時移植骨髓細胞和基質細胞，也許可作為一種新的高效骨髓移植方法。本研究目的即利用前期構建的VMBT 模型［3-4］，探索其造血重建潛能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物近交系Lewis（RT11）大鼠共27只、鼠齡6～8 周，210～230 g、雄性、購自維通利華，動物質量合格證號：SCXK（京）2017-0008。飼養條件為SPF 級，實驗動物飼養設施合格證號：SYXK（粵）2019-0100。

1.2 試劑與儀器青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠）；戊巴比妥（百瑞金生物）；紅細胞裂解液（BioLegend，美國）；1640 培養基和胎牛血清（Hyclone，美國）；小鼠抗大鼠PE-CD90 單抗（eBioscience，美國）；小鼠PE-IgG1 同型對照抗體（BioLegend，美國）；生物學X-ray 輻照儀（Rad Source，美國）；自動細胞計數儀（Inno-Alliance Biotech，美國）。

1.3 實驗分組以Lewis 近交系大鼠為動物進行同品系間的骨髓移植，受體移植前1 d 給予5 Gy（1 050 Gy/min）的X 線放射清髓，然后移植骨髓。根據骨髓移植方法的不同分為3 個組，每組6 只：VBMT 組（實驗組）移植完整的股骨；i.v.BMT 組（陽性對照組）靜脈注射與單根股骨骨髓含量相當的骨髓細胞，約5 × 107/0.5 mL；Control 組（陰性對照組）注射等量生理鹽水。

1.4 骨髓移植

1.4.1 帶血管的骨髓移植手術步驟同前報道［5］。簡單說即切開供體腹股溝區，剝離皮下、暴露股動脈和膝關節；結扎股動脈發出的肌支、腹壁淺和隱動靜脈；剝離膝關節周圍的肌群；結扎腘動脈的其他分支僅保留分出的膝降動脈；然后分離股動靜脈，并保護股深動靜脈；最后切斷膝關節和髖關節周圍的肌肉和韌帶，游離出股骨。同樣，受體也于腹股溝區做一切口，剝離股動靜脈；然后移植供體股骨，股骨頭朝內，置于受體腹股溝區，11-0 顯微線吻合供受體間的股動靜脈，關閉皮膚切口，手術結束（圖1）。術后連續3 d 腹腔注射青霉素，10 萬U/（kg·d）預防感染。

圖1 股骨移植后第10天可見表面肌肉紅潤、血管蒂搏動良好Fig.1 The transplanted femur was covered by pink muscle tissues with a patent vessel pedicle on postoperative day 10

1.4.2 靜脈骨髓移植取大鼠股骨和脛骨，以5 mL含2 %胎牛血清的1640 培養基反復沖洗骨髓腔，收集細胞懸液，200目篩網過濾；350 g離心5 min，去上清后加入2 mL 1×RBC lysis Buffer 裂紅3～5 min；再加10 mL PBS 終止裂紅，離心后PBS 重懸。然后將所得細胞懸液稀釋后，與0.2 %臺盼藍1∶1 等體積混合，自動細胞計數儀進行計數。根據計數結果吸取5 × 107/0.5 mL 的骨髓細胞，經大鼠陰莖背靜脈注射骨髓細胞或生理鹽水。

1.5 檢測指標所有受體于清髓前、清髓后第5、10 和15 天，斷尾采血0.3～0.5 mL，血細胞分析儀上監測受體外周血中各種群細胞數的變化。清髓后第10 天處死部分大鼠，剝離脾臟，去除周圍的脂肪和筋膜組織后于萬分之一電子天平稱重，計算脾臟指數。脾臟指數=脾臟質量（mg）/鼠質量（10 g）。脾臟常規行HE 染色切片，而骨組織需甲醛固定后再用10%EDTA 脫鈣，每6 h 更換一次脫鈣液，直到大頭針能輕松刺進骨密質為完成脫鈣標準，切片（3～5 μm），HE 染色。清髓后第10 天，分別制備受體股骨和脛骨的骨髓細胞懸液，細胞計數（方法同前）。同時從中吸取100 μL 的單細胞懸液（約106個細胞），加入Anti-Rat CD90 PE 或者IgG2a-PE，室溫避光染色15～30 min；流式洗液洗滌2～3 次后500 μL PBS 重懸，流式檢測。

1.6 統計學方法所得數據以均數±標準差表示，應用SPSS 20.0統計軟件分析行成組t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血各種群細胞的恢復各組大鼠經5 Gy的X 線照射后白細胞和血小板數均顯著減少，第5 天時已減少90%以上。之后VBMT 或i.v.BMT 組白細胞逐漸恢復，且恢復速度明顯快于對照組，到第15 天時VBMT 組已大致接近照射前水平，i.v.BMT 恢復雖然稍慢于VBMT，但差異無統計學意義。對照組未給予骨髓移植，白細胞恢復遲緩，與i.v.BMT（P=0.003）和VBMT（P＜0.001）相比差異均有統計學意義（P＜0.05，圖2A）。同樣，VBMT或i.v.BMT 組血小板恢復速度也明顯快于對照組（P＜0.05，圖2B）。

圖2 VBMT 和i.v.BMT 均促進了部分清髓受體白細胞和血小板的恢復Fig.2 Both VBMT and i.v.BMT accelerated recovery of the leukocytes and platelets of nonmyeloablative recipients

2.2 脾集落的生成脾集落是機體受到電離輻射后，造血干細胞遷移到脾臟起代償性造血的造血灶。它與骨髓中具有增殖分裂能力的造血干細胞數量呈良好的線性關系。在小鼠中脾集落形成較為明顯，但本實驗中由于放射劑量僅為5 Gy，且大鼠脾臟較大，表面結節不易觀察，故對比各組的脾臟指數。放射后10 d可見對照組脾臟明顯萎縮，脾臟指數也較低，僅為正常脾臟大小的1/2。i.v.BMT組也發生了輕度的萎縮，且與正常脾指數相比差異有統計學意義（P=0.003），但明顯高于對照組（P＜0.001）。而VBMT 組脾臟不但未萎縮，反而有增加趨勢，脾臟指數略高于正常脾，但差異無統計學意義（P=0.323，圖3）。

圖3 脾臟大體觀察及脾臟指數變化Fig.3 Gross appearance of the spleens and changes of spleen index after nonmyeloablative irradiation

病理學結果和大體觀察類似，正常脾白髓紅髓結構清楚，白髓內可見明顯的淋巴小結，紅髓區脾索內也可見大量淋巴細胞，脾血竇充血富含紅細胞。但照射后10 d 對照組發生了明顯的損傷性變化，白髓內淋巴小結萎縮甚至消失，其中淋巴細胞數顯著減少，紅髓內有核細胞也減少。而VBMT 組脾臟組織結構有好轉趨勢，如白髓內雖然結構較紊亂但淋巴小結增多，周圍淋巴細胞也明顯增加，脾索內可見大量有核細胞。i.v.BMT 組與VBMT 組表現類似（圖4）。

圖4 放射后10 d 脾臟HE 染色結果（×40）Fig.4 Hematoxylin and eosin staining results of spleen on 10th day after irradiation（×40）

2.3 造血系統的重建術后10 d 可見移植股骨表面肌肉紅潤，血管蒂通暢，見圖1。骨髓HE 染色與正常骨髓無異可見大量排列緊密的嗜堿性骨髓細胞，邊緣清晰，而放射后各組骨髓細胞顯著減少，尤其對照組骨髓細胞幾乎消失，大部分骨髓被類似脂肪空泡性組織所取代，僅散在的分布少數骨髓細胞。而VBMT 和i.v.BMT 組明顯優于對照組，雖然髓腔內也可見大量空泡性組織，但仍有稀疏的骨髓細胞分布（圖5）。

圖5 放射后10 d 骨髓HE 染色（×40）Fig.5 Hematoxylin and eosin staining results of bone marrow on 10th day after irradiation（×40）

骨髓細胞計數的結果與HE 染色類似，無論股骨還是脛骨，VBMT或i.v.BMT都加速了骨髓的再生或恢復，骨髓細胞數雖少于正常骨髓，但較對照組高一個數量級（P=0.002）。不過VBMT組雖有高于i.v.BMT 的趨勢但兩者間差異無統計學意義（圖6）。進一步比較各組CD90+干細胞數，發現VBMT、i.v.BMT及對照組分別為（21.3±3.5）%，（31.5±1.7）%，（30.1 ± 4.5）%均高于正常組（17.7 ± 2.8）%，且除VBMT 組外差異有統計學意義，提示放射后各組可能均處于活躍造血中。

圖6 放射后10 d 各組脛骨和股骨骨髓細胞計數結果Fig.6 Total number of BMCs in tibia and femur on 10th day after irradiation

3 討論

骨髓中除干細胞外還存在著由毛細血管竇組成的毛細血管網、骨髓內骨架組成的骨小梁網和各種間質（網狀）細胞組成的間質細胞網等［6］。而造血細胞即填充于這些網絡間隙中，以灶狀造血結構的形式存在。周圍的各種基質細胞除為造血細胞提供特殊的接觸表面外，同時還產生細胞外基質（ECM）成分和造血生長因子，為造血細胞提供生長所需的空間和營養成分，對骨髓功能的正常發揮起著不可或缺的作用［7-8］。本研究在基本不破壞骨髓微環境前提下，同時移植骨髓細胞和微環境，成功加速重建了部分清髓受體的造血系統。這種移植方式有可能作為一種更加高效的骨髓移植方法。因為在其自身的微環境中，不存在MHC 限制性的問題，骨髓細胞可更好的保持自身增殖和分化能力，持續為清髓受體提供基質細胞和造血干細胞。文獻報道，靜脈骨髓移植聯合供體去骨髓的骨瓣皮下或腎包膜下移植可顯著增加9 Gy 清髓受體的脾集落數，且可完全防止系統性紅斑狼瘡小鼠疾病的發生，而單獨移植造血干細胞或骨瓣均無效［9-10］。同樣，國內研究也發現骨髓細胞聯合成骨細胞或間充質干細胞可促進清髓受體的造血或耐受的誘導［11-12］，說明了骨髓基質環境的重要性。這也是門靜脈注射全骨髓細胞（含基質細胞）優于傳統的靜脈骨髓的原因之一，因為門脈注射的骨髓細胞和基質細胞共同阻滯于肝臟內，早期即可在局部相互作用形成了一個造血灶，然后再逐步遷移到全身［13-14］。這一點也與VBMT的造血模式比較相似，首先移植股骨內自我造血，然后再逐步遷移到受體骨髓發揮造血作用。

然而，本研究雖然VBMT 有優于i.v.BMT 的趨勢，但差異并無統計學意義，這與以往文獻報道的VBMT 優于i.v.BMT 不同［4，15］。分析其原因，可能與實驗樣本數偏少有關。另外，可能也與本研究所采用的模型和放射劑量相關。因為以往是將大鼠后肢移植給經致死劑量照射的大鼠，而本研究為了排除皮膚、皮下、淋巴等其他組織的影響，采用了一種成分更加單一的模型，即單純的股骨，從而使兩者更加具有可比性。另外，本研究僅給予5 Gy 的劑量照射，使受體體內原有的基質細胞得以存活，為靜脈骨髓細胞的生長增殖提供了有利條件［16］，對照組所有大鼠無需骨髓移植即可自我恢復充分說明了這一點。

目前，對于帶血管的骨髓移植主要集中異體復合組織移植。因為某些復合組織移植物如手、臉等本身即含有骨瓣，因而研究其中骨髓對于耐受誘導有重要的臨床意義［16］。現在已有研究證實，復合組織中的骨瓣在特定的免疫誘導方案下，無需放射清髓和額外的骨髓移植即可自我誘導耐受［4，15］。而靈長類動物實驗也發現，在同樣的免疫抑制方案下臉移植時如果附帶骨瓣則可長期存活，而不帶骨瓣則早期排斥，都說明了骨瓣中骨髓的重要作用［17-19］。因此，課題組后續的實驗將重點探索帶血管的骨髓移植的免疫誘導潛能，從而為其臨床應用提供可能的理論基礎。