何首烏及炮制品中二苯乙烯苷的穩定性研究*

柴士偉，邢彥超，高建，龐旭，韓立峰

（1天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301617）

何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）是享譽中外、延用千年的知名中藥。其生品具有解毒消癰和潤腸通便的功效，而炮制品主要是通過滋補肝腎而表現出諸多補益功效，包括益精血、強筋骨、烏須發等[1]。現代藥理學研究證明何首烏的藥理活性主要表現為抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗衰老、增強免疫功能、降血脂和神經保護等方面，并具有治療神經退行性疾病、降血糖等方面的潛力[2-3]。文獻報道何首烏的炮制方法較多，而炮制中所用到的炮制輔料多達十幾種，包括黑豆、黃酒、黑芝麻、牛膝、干棗、人乳、牛乳、醋、米泔水和甘草等，其中以黑豆炮制記載最多[4-5]。炮制工藝主要以“蒸制”為主，其中“九蒸九曬”的炮制工藝被譽為是何首烏最為經典的炮制方法，同時也是工序最為繁瑣且極其耗時的炮制方法[6]。研究選用“蒸制”工藝，選取不同的輔料炮制，對各炮制品及生品中 2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（TSG）的穩定性進行研究。考慮到傳統的何首烏炮制方法大都經歷“蒸”和“曬”的操作，而古人用到的水為富含各種金屬離子的水，同時在重要的煎煮、貯藏和其他加工條件下也或多或少經歷光照和高溫等條件。因此，實驗中對光照、高溫和金屬離子等3個因素對TSG的穩定性影響進行了系統研究。

何首烏中含有多種具有生物活性的化合物，例如二苯乙烯類、蒽醌類、酚酸類等。二苯乙烯類成分為何首烏中存在含量較高的大類成分，已被發現高達幾十種[7]。TSG是何首烏中含量最高的二苯乙烯類化合物，同時也是中國藥典的指標成分，是近年來何首烏的活性、毒性研究熱點。TSG具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和清除自由基等[8]。與此同時，關于它影響代謝酶的研究也有諸多報道[9-12]。該化合物作為二苯乙烯類化合物，由于雙鍵的存在而天然存在順（cis-）、反（trans-）兩種構型，已有文獻報道在某些特定條件下，順反構型可反生相互轉化[13-14]。作為傳統的補益類中藥，在中醫藥典籍中記載的“九蒸九曬”和“忌鐵器”等理論可能體現了古代中醫藥學者對何首烏中化合物穩定性的相關認識[15]。為了全面了解TSG的穩定性以及復雜體系的藥材何首烏中TSG的穩定性，有必要進行系統的考察。因此，實驗對TSG單體、何首烏生品以及4種炮制品在光照、高溫和金屬離子（Fe3+）介導的穩定性進行了系統研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-四級桿靜電場軌道阱質譜聯用儀（UHPLC/ESI-Q-Orbitrap MS），美國賽默飛世爾有限公司；1260 Infinity高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；微量移液器，德國艾本德生命科學有限公司；渦旋振蕩器，美國萊伯特公司；TSG（批號：Must-16121311，純度：98.72%），成都曼特生物科技有限公司；分析純乙醇（天津協和科技有限公司），色譜純乙腈、甲醇，美國賽默飛世爾公司；超純水，美國Millipore公司；乙酸，美國ACS恩科化學公司；Centrifuge 5424 R冷凍臺式高速離心機（離心機半徑為150 mm），德國艾本德生命科學有限公司。

何首烏、黑豆均夠自安國祁安藥業有限公司，何首烏藥材經天津中醫藥大學張麗娟教授鑒定為廖科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥根莖，樣品標本保存于天津中醫藥大學中醫藥研究院（PM-20160432）。黑豆經張麗娟鑒定為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr的干燥成熟種子，樣品標本保存于天津中醫藥大學中醫藥研究院（GM-20170530）。黃酒夠自浙江紹興第三釀酒廠。

1.2 樣品制備方法

1.2.1 何首烏炮制品及其分析樣品的制備 根據前期研究工作基礎[5]，各何首烏炮制品制備工藝如下。何首烏清水蒸制品組（Q）：超純水拌勻浸漬何首烏藥材后，蒸制32 h；何首烏黃酒炮制品（J）：黃酒拌勻浸漬何首烏藥材后，蒸制32 h；何首烏黑豆汁炮制品（D）：黑豆汁拌勻浸漬何首烏藥材后，蒸制32 h；何首烏黑豆汁合并黃酒炮制品（DJ）：黑豆汁合并黃酒拌勻浸漬何首烏藥材后，蒸制32 h。分別稱取何首烏生品（SP）及其 4種炮制品（Q，D，J和 DJ）各10 mg于1.5 mL離心管中，分別加入1 mL超純水，封口膜封口后渦旋震蕩5 min，超聲提取30 min后，14 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液加入附有內插管的進樣小瓶中。

1.2.2 光照樣品的制備 分別用超純水、50%乙醇和乙醇為溶劑配置成濃度0.1 mg/mL的TSG溶液。3組樣品命名為超純水組、50%乙醇組和乙醇組。將以上3份樣品分別均勻平鋪于培養皿中并存放在戶外陽光下。在不同時間點（0.5、1、2、3、4、5 h）取樣，過濾并分析。

用超純水制備濃度為10 μg/mL二苯乙烯苷溶液10 mL。分別稱取SP及其4種炮制品（Q，D，J和DJ）各10 mg于1.5 mL離心管中，分別加入1 mL超純水，封口膜封口后渦旋震蕩5min，超聲提取30min后，14 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，再分別稀釋成含有10 μg/mL的TSG溶液10 mL。將以上6份樣品分別均勻平鋪于培養皿中并存放在戶外陽光下。在不同時間點（0.5、1、2、3、4、5 h）取樣，過濾并分析。

1.2.3 高溫實驗樣品制備 用超純水制備濃度為10 μg/mL的TSG溶液10 mL。分別稱取SP及其4種炮制品（Q，D，J和 DJ）各 10 mg于 1.5 mL離心管中，分別加入1 mL超純水，封口膜封口后渦旋震蕩5min，超聲提取30min后，14000r/min離心10min，離心半徑10 cm，再分別稀釋成含有10 μg/mL TSG的溶液10 mL。將以上6份樣品一同放入100℃水浴鍋中，全程避光。在不同時間點（0、2、4、6、8、10 h）取樣，過濾并分析。

1.2.4 金屬離子實驗樣品制備 用超純水制備濃度為10 μg/mL的TSG溶液10 mL。分別稱取SP及其 4種炮制品（Q，D，J和 DJ）各 10 mg于 1.5 mL 離心管中，分別加入1 mL超純水，封口膜封口后渦旋震蕩5 min，超聲提取30 min后，14 000 r/min離心10min，離心半徑10cm，再分別稀釋成含有10μg/mL二苯乙烯苷和100 μg/mL氯化鐵（FeCL3）的溶液10 mL。將以上6份樣品室溫下避光保存。在不同時間點（0、2、4、6、8、10 h）取樣，過濾并分析。

1.3 分析方法

1.3.1 何首烏及其炮制品的分析 超高效液相色譜方法：用反相柱BEHC18（1.7μm，250×4.6 mm，Waters）在35℃下，對樣品進行分離。流動相為0.1%乙酸-水溶液（A）和乙腈（B）。梯度洗脫條件為乙腈（B）從5%至100%，運行時間為25 min。進樣體積為2 μL，流速為0.4 mL/min。

質譜方法：UHPLC/ESI-Q-Orbitrap MS液質聯用系統，負離子檢測，配有加熱的電噴霧離子源（HESI），采用 Full MS/dd-MS2（TopN）的掃描方法對何首烏樣品中成分進行檢測。具體參數為：源噴霧電壓：-2.8 kV，鞘氣（N2）35 L/h；輔助氣（N2）10 L/h；吹掃氣（N2）0 L/h；毛細管溫度350℃；輔助氣加熱溫度350℃。MS1全掃描范圍是m/z 100～1 500，分辨率是70 000；MS2質譜掃描是動態質量范圍，分辨率是17 500。所有操作均由Xcalibur軟件（版本3.1，Thermo Scientific，USA）控制。

1.3.2 何首烏中二苯乙烯苷的分析 使用安捷倫1260高效液相色譜法對TSG進行檢測。使用反相SB-C18 柱（150mm×4．6mm，5μm，Agilent Technologies Inc．，USA），在30℃下測定TSG。流動相為水和乙腈75∶25（V/V）。進樣體積為 10 μL，流速為 1 mL/min，運行時間為10 min。應用紫外可變波長檢測器（VWD）在320 nm波長下進行檢測。

2 實驗結果

2.1 TSG標準品和何首烏不同樣品中的TSG在不同處理條件下隨時間變化結果 TSG標準品和何首烏不同樣品中的TSG在不同處理條件下隨時間變化的折線圖如圖1所示。圖1A的結果表明：TSG在水、50%乙醇和乙醇溶液中經光照均能異構化為cis-TSG，轉化速率和反應平衡點沒有明顯的差異。實驗結果進一步說明了光照是何首烏中TSG異構化的敏感因素，而反應過程并不局限于特定溶劑。從圖1B的結果表明：在所有組中，各組間無明顯差異，何首烏中的TSG與TSG標準品無差異，同樣不穩定，易發生異構化反應。在本實驗中，反應達到平衡點時，順式結構的峰面積大于反式結構的峰面積，轉化率超過50%，轉化率的高低可能與濃度有關。圖1C的結果表明：在100℃高溫水浴下，各組中TSG的含量均隨時間逐漸減少，呈現時間依賴性，而各組整體趨勢無明顯差異。圖1D的結果表明：在反應前期各組中TSG的含量均隨時間逐漸減少，之后便趨于穩定，各組整體趨勢無明顯差異。

圖1 TSG標準品和何首烏不同樣品中的TSG在不同處理條件下隨時間變化的折線圖Fig.1 Line chart of TSG in different samples of fallopia multiflora and TSG standard under different treatment conditions at different time

2.2 TSG光照順反異構可能機制 TSG經光照的順反異構化由trans-TSG在光照的條件下經過二苯乙烯骨架C=C雙鍵的P-垂直中間態扭轉實現相的轉變，如圖2所示[16]。有研究表明，cis-TSG具有降低血糖的藥理作用[17]，也有研究表明它會造成肝損傷[18-19]。因此，cis-TSG的相關研究對研究何首烏的藥理活性和致毒物質基礎具有參考價值，對何首烏的質量控制和臨床應用具有一定的指導意義。

圖2 TSG經P-垂直中間態扭轉的順反異構化過程Fig.2 Cis/trans isomerization of TSG by P-vertical intermediate state

2.3 TSG高溫降解可能機制 何首烏的炮制工藝幾乎均涉及“蒸制”，時間長達十幾個小時甚至更久，如此長時間的高溫接觸勢必會對何首烏中TSG的穩定性產生較大影響，故炮制后其含量會明顯降低。TSG發生高溫降解反應的可能的機制如圖3所示[13]。

圖3 TSG高溫降解反應過程圖Fig.3 Reaction process chart of high temperature degradation of TSG

2.4 金屬離子對TSG穩定性的影響 何首烏及TSG單體在Fe3+作用下發生反應。在反應前期，折線的斜率的大小順序為：TSG＞SP＞D＞Q＞J＞DJ。在穩定階段，峰面積大小的順序為 DJ＞J＞Q＞D＞SP＞TSG。造成各組之間存在明顯差異的原因之一可能是何首烏中的一些其他成分也可以與溶液中的Fe3+發生反應，這些化合物的結構可能類似于TSG，并與其存在競爭關系。文獻報導各種金屬離子均會影響二苯乙烯苷的穩定性，如 Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Al3+和Fe3+。Fe3+和Fe2+可能主要參與催化TSG的氧化聚合，而 Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+和 Al3+可能主要參與雙鍵氧化分解反應，TSG的二聚體生成的可能機制之一如圖4所示[20]。TSG與不同的金屬離子反應的確切機制有待進一步研究和闡明。何首烏的加工和煎煮需要用水，而中國古代沒有凈化水的技術，人們通常用井水來處理和蒸煮何首烏。井水含有許多金屬離子，它們可能影響TSG的穩定性。

圖4 TSG二聚體生成的可能機制Fig.4 Possible formation mechanism of TSG dimer

另一方面，金屬離子亦可以與中藥中的化合物形成配合物，包括金屬離子絡合物在內的中藥成分的配合物在某些中藥臨床應用中起到至關重要的作用。有些成分由于相互影響（物理吸附或化學反應）而產生新的物質-配位絡合物和分子絡合物，這些新物質可能改變了原來各組分的溶解度、吸收光譜等物理性質，進而也可能對其藥效產生影響。例如黃芩苷在溶液中與鋅或銅形成的配合物對紅細胞膜的保護作用優于黃芩苷本身，對氧自由基具有明顯的清除作用，并呈量效關系；與鋁形成的絡合物黃芩苷鋁，作為抗菌收斂藥用于臨床，兼有黃芩苷抗菌和鋁收斂之雙重功效。而生物堿類、黃酮類、蒽醌類等成分分子間又可通過靜電、疏水、包合、交疊等作用結合成分子絡合物，改變中藥原有成分的溶解度、熔點、親脂性、立體構型、紫外和紅外光譜等理化性質，從而引起藥理活性或者毒性作用的。例如喜樹堿具有抗癌作用，但有毒性，當其與甘草酸配伍后，喜樹堿生成分子絡合物，不僅增強喜樹堿抗癌作用，而且使其毒性降低[21-22]。故何首烏中的二苯乙烯類、蒽醌類和黃酮類等成分可能與鐵離子等金屬離子形成配合物，是否會對藥效和毒性產生影響是值得繼續探討的。

3 結論

實驗考察了光照、高溫和Fe3+對TSG、何首烏生品和炮制品穩定性的影響，結果表明這3個因素均對TSG的穩定性造成了影響，同時這些因素對藥材中的TSG的影響是基本一致的。其中光照、溫度等因素對TSG單體、何首烏生品及其炮制品中TSG的影響并不存在明顯差別，而在TSG的Fe3+穩定性的實驗中，何首烏生品及其炮制品中反應平衡點存在明顯差別，原因可能是何首烏中的其他相似結構的二苯乙烯類等其他成分與TSG競爭消耗Fe3+所致。TSG在適宜的條件下經光照發生順反異構，經高溫反生降解反應，而在含有Fe3+的溶液中可能生成相應的聚合物。研究為何首烏的加工、貯藏、炮制和制劑等體外過程的標準化奠定了基礎，對進一步研究其中的物質基礎和轉化規律具有一定的參考價值，為相似成分的穩定性研究提供了參考。