二黃益腎湯調控TGF-β1/Smad 信號通路治療慢性腎功能衰竭研究*

董彬，于斌，孫閔，劉志華，王樂榮，王祥生

（1.濟寧市中醫院，濟寧 272004；2.濟寧醫學院中西醫結合學院，濟寧 272067）

慢性腎功能衰竭（CRF）作為不可逆性疾病，呈慢性進展，最終發展為終末期腎病，需腎臟替代治療，臨床治療頗為棘手。其主要表現為全身代謝功能紊亂、多系統衰竭，預后一般較差。一般認為，本病的發病與腎間質纖維化密切相關，是導致腎臟結構和功能障礙的主要原因。中國CRF 患者數量高達1.2 億，造成嚴重的經濟與社會負擔。本病的主要病因與外感、內傷有關，病機以本虛標實、標本兼夾為主，本虛表現為氣血陰陽的不足，標實主要以濕熱瘀毒痰為主，病變部位在腎，涉及脾、胃、心、肝、肺及三焦、膀胱等，以脾腎虧虛為主[1]。隨著中醫藥治療慢性病優勢的凸顯，中醫藥不僅能夠改善CRF 患者的臨床癥狀及相關檢測指標，延緩CRF 的快速進展，更能改善患者遠期病死率，提升遠期存活率。

二黃益腎湯主要由黃芪、淫羊藿、大黃、白術、白花蛇舌草、六月雪、莪術、石韋、丹參、砂仁等藥物組成，具有補腎健脾、活血通絡、清熱泄濁之功效，可降低內生肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，是濟寧市中醫院用于氣虛濕瘀型CRF 患者治療的協定處方[2-3]。轉化生長因子（TGF）-β1 是TGF 家族成員，是較強的促纖維化因子，Smad 是TGF-β 家族的信號傳導分子，TGF-β1 活化后與Smad3 相互識別，TGF-β1/Smad 信號通路在組織纖維化的形成過程中發揮重要作用[4]。然而對于二黃益腎湯治療CRF腎纖維化的機制與TGF-β1/Smad 信號通路的相關性研究較少，本項目通過5/6 腎切除建立CRF 動物模型，并采用二黃益腎湯進行治療，分析其對TGFβ1/Smad 信號通路的影響，試闡述其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑和儀器 尿毒清顆粒（廣州康臣藥業有限公司生產），規格為5 g/袋。TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7 購自Abcam 公司，引物購自上海生物工程公司，實時定量-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自天根生化科技有限公司。5424 型小型高速離心機（德國Eppendorf 公司），BioRad CFX96 熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測系統（美國BioRad公司）。

1.2 實驗動物 SPF 級SD 大鼠40 只（實驗動物許可證號：SCXK 魯20140007），購自山東朋悅實驗動物中心。

1.3 動物模型建立及篩選 選取10 只大鼠作為正常組，不進行干預。其余30 只大鼠參考文獻方法[5-6]，采用5/6 腎切除方法建立CRF 動物模型。術前常規消毒，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，在左側肋弓下0.5 cm、脊柱向左旁開1 cm 處切開一垂直于脊柱、長約2.5 cm 的切口。暴露左側腎臟，結扎左側腎動脈的2/3 分支后縫合，7 d 后予同法摘除右側腎臟。術后4 周眼眶后靜脈叢采血，進行血清BUN、Scr測定，以BUN、Scr 數值大于健康大鼠2 倍確立模型建立成功。后將模型動物依據Scr 數值隨機分為模型組、二黃益腎湯組及尿毒清組，每組10 只。

1.4 干預方案 模型篩選后進行藥物干預，根據人與大鼠體表面積換算公式計算，二黃益腎湯臨床等效劑量為18.93 g/kg，尿毒清臨床等效劑量為2.25 g/kg。二黃益腎湯組成：黃芪15 g，大黃10 g，炒白術15 g，白花蛇舌草20 g，淫羊藿15 g，六月雪30 g，莪術15 g，石韋40 g，丹參40 g，砂仁12 g，藥材購自濟寧市中醫院藥房。干預方式為灌胃治療，干預時間為12 周。

1.5 檢測指標

1.5.1 血清Scr、BUN 水平檢測 實驗結束后，采用戊巴比妥鈉進行動物麻醉，腹主動脈采血，全自動生化分析儀檢測血清Scr、BUN 水平。

1.5.2 病理學檢測 腎組織經4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明處理、石蠟包埋、切片（厚度為4～5 μm）后常規蘇木精-伊紅（HE）染色，OLMPUS 顯微鏡觀察各組腎組織病理變化并拍照。

1.5.3 腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA 表達量檢測 腎臟組織經TRIzol 提取總RNA 后，進行反轉錄，之后進行RT-PCR 檢測。檢測指標為TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7。β-actin為內參，用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.5.4 腎臟組織TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7蛋白表達量檢測 組織經裂解后進行蛋白提取和定量，之后進行SDS-PAGE 電泳，抗體孵育及發光顯色后，進行應用凝膠成像系統掃描，采用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析，TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 蛋白相對表達量以目的蛋白與內參β-actin 的灰度值的比值表示。

1.6 統計學處理 應用SPSS 22.0 軟件包進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法；計數資料以百分比或率表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型動物篩選及一般情況觀察 模型建立4 周后，分析BUN 和Scr 水平。結果顯示，模型組BUN、Scr 水平與正常組相比呈現增高趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.01），說明CRF 腎纖維化動物模型建立成功，見表2。正常組大鼠精神狀態、生長速度、進食和排便均正常，反應靈敏。模型組動物精神狀態萎靡，增長較慢，體毛稀疏，飲水量增加，體質量減輕，被毛無光澤，活動減少，應激反應較差。

表2 正常組與模型組大鼠BUN、Scr 含量檢測（±s）

表2 正常組與模型組大鼠BUN、Scr 含量檢測（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01。

組別動物數Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）正常組型動物1024.20±2.105.46±0.24模3073.80±3.19*14.15±2.39*

2.2 二黃益腎湯對模型動物腎臟組織病理影響 正常組大鼠腎組織染色均勻，腎小管大小、形態正常，腎間質未見明顯病理改變。模型組大鼠表現出廣泛的腎結構損傷和形態改變，腎小管上皮萎縮，腎小管管腔擴張，間質炎性細胞浸潤和腎小管壞死。二黃益腎湯組和尿毒清組腎間質內有少量炎性細胞浸潤及纖維組織增生，腎小管擴張程度較輕，腎小囊擴張，但纖維化的面積較模型組小，仍保留部分正常腎小管結構。病理結果顯示，二黃益腎湯和尿毒清治療后能夠改善CRF 腎纖維化病變程度。見圖1。

圖1 各組大鼠HE 染色結果（×200）

2.3 二黃益腎湯對腎功能BUN、Scr 的影響 結果顯示，模型組大鼠BUN、Scr 含量高于正常組，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，二黃益腎湯組和尿毒清組BUN、Scr 含量呈現降低趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.01）。二黃益腎湯組BUN、Scr降低趨勢較尿毒清組明顯。見表3。

表3 各組大鼠BUN、Scr 含量（±s）

表3 各組大鼠BUN、Scr 含量（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別動物數Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）正常組1024.20±2.105.04±0.31模型組1064.60±2.27*13.22±1.21*尿毒清組1044.00±2.98#7.76±0.55#二黃益腎湯組1038.50±2.95#6.70±0.48#

2.4 二黃益腎湯對腎臟組織TGF-β1/Smad 信號通路mRNA 的影響 RT-PCR 結果顯示，與正常組相比，模型組TGF-β1、Smad3 和Smad4 mRNA 表達升高，Smad7 mRNA 表達降低，各指標差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，二黃益腎湯組和尿毒清組TGF-β1、Smad3、Smad4 mRNA 的表達量呈現降低趨勢，而Smad7 mRNA 的表達量呈現升高趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA表達量（±s）

表4 各組TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 mRNA表達量（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數 TGF-β1Smad3Smad4Smad7正常組101.001.001.001.00模型組103.07±0.03** 2.75±0.06** 2.05±0.19** 0.82±0.20*尿毒清組101.78±0.04## 2.24±0.08# 1.48±0.22## 1.22±0.16##二黃益腎湯組100.78±0.10## 2.10±0.08## 1.43±0.12## 1.04±0.13#

2.5 二黃益腎湯對腎臟組織TGF-β1/Smad 信號通路蛋白的影響 Western Blot 檢測結果顯示，與正常組相比，模型組TGF-β1、Smad3 和Smad4 的蛋白表達量升高，而Smad7 的蛋白表達量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，二黃益腎湯組和尿毒清組TGF-β1、Smad3、Smad4 的蛋白表達量降低，而Smad7 蛋白的表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 TGF-β1、Smad3、Smad4 和Smad7 的蛋白表達量（±s，n=10）

3 討論

CRF 屬于中醫“關格”“癃閉”“虛勞”等范疇，多為其他慢性疾病或并發癥遷延不愈發展而來，常見于水腫、淋證、消渴、尿血、眩暈等疾病后期。其基本病機為脾腎虧虛，濕濁內蘊，病變部位主要在脾、腎，并與腸相關。本病的發病主要與濕、濁、瘀、毒相關，是病情演變及加重的主要因素，且貫穿于本病的始終。因而一些醫家主張補脾益腎治其本，化濕泄濁治其標[7]。

二黃益腎湯方中黃芪、淫羊藿為君藥，主要用于補腎健脾、利水消腫，針對脾腎虧虛起到補養作用。砂仁化濕行氣，白術益氣健脾、燥濕利水，兼助黃芪補氣，兩藥針對濕濁起到化濕泄濁的效果。莪術破血行氣消積，丹參活血祛瘀止痛，兩藥主要用于活血化瘀通絡，合用針對濕、濁、瘀、毒起到治療效果，共為臣藥。大黃通腑泄濁，配伍丹參又可活血逐瘀；白花蛇舌草清熱利濕解毒；六月雪清熱利濕、舒筋活絡，加用石韋共助濕濁從小便而解，上述4 味共為佐藥，使邪有出路。大黃兼為使藥，引藥入血絡，使久病頑疾邪去正安。全方共奏補腎健脾、利濕泄濁、活血化瘀之效，標本兼治。

CRF 的發病主要與自身免疫反應、感染、藥物應用、遺傳因素、環境和飲食因素等相關，并與腎小管間質和腎小球纖維化有關[8]。研究發現，TGF-β1是參與腎間質纖維化的主要細胞因子，而Smads 信號通路是TGF-β1 促纖維化的中心調控環節，TGFβ1 可刺激纖維細胞增殖并促使其產生膠原蛋白，抑制細胞外基質降解，Smads 是TGF-β1 的下游調控因子。TGF-β1 與細胞膜上的受體結合后，激活細胞內Smad2、Smad3 并促使其磷酸化活化，促進TGF-β1信號轉入細胞核，發揮其促纖維化作用。Smad6 可以抑制Smads，并阻斷TGF-β1 信號轉導[5]。

黃芪是治療CRF 的常用有效中藥之一，研究表明黃芪通過抑制TGF-β1 信號通路的激活對CRF具有一定的抗纖維化和抗炎作用，并且能夠降低BUN、Scr 水平[9]，與本研究結果一致。研究發現淫羊藿可以降低CRF 患者可溶性白細胞介素（IL）-2 受體、IL-6 和干擾素-α（IFN-α）含量，并且淫羊藿單體能夠抑制活化的成纖維細胞和系膜細胞增殖以及TGF-β1 表達，從而發揮防治腎纖維化作用[10]。研究認為砂仁的乙酸乙酯層提取物具有較強的抗氧化作用，砂仁多糖具有很強的清除自由基的活性作用，可能與其抗纖維化機制相關[11]。白術內酯Ⅰ和白術內酯Ⅲ具有明顯的促進促炎性巨噬細胞因子的表達作用，具有一定的抗炎活性，另有研究證實，白術具有一定的抗氧化能力[12]。Cohly 等[13]研究發現莪術發揮抗氧化作用體現在其中的姜黃素成分能夠抑制脂質的過氧化，降解細胞凋亡基因Fas-L、Fas表達并溶解細胞來保護受損的腎細胞[14]。劉遲等[15]檢測研究莪術降低單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化中TGF-β1、核轉錄因子-κB（NF-κB）、Ⅳ型膠原等相關纖維化指標的表達。丹參主要成分是丹參酮ⅡA，具有改善微循環、抗纖維化的作用。陸海英等[16]發現丹參酚酸B 抑制腎組織基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）的表達，改善大鼠纖維化水平。另有研究發現丹參能夠抑制促炎性細胞因子的釋放和氧化應激反應，抑制腎小管間質轉化，主要機制與其能夠拮抗TGF-β1的纖維化作用相關[17]。大黃酸和大黃素是大黃的主要活性成分，研究發現大黃酸能夠抑制腎間質纖維化，改善腎臟微循環，大黃素可以抑制腎小球纖維化，大黃提取物能夠抑制TGF-β1/Smad3 的信號活化，增加Smad7 含量，從而通過調控TGF-β/Smad 信號通路發揮抗纖維化作用[18]。另有研究證實大黃酸可以抑制TGF-β1、結締組織生長因子（CTGF）的基因表達，從基因水平抑制細胞外基質（ECM）積聚[5]。研究證實，白花蛇舌草的水提液具有腎臟保護作用，能夠降低腎臟腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 和IL-10等炎性因子的表達，白花蛇舌草具有較好的抗纖維化作用，網絡藥理學研究發現其作用機制可能與TGF-β 信號通路、腎細胞癌信號通路和Janus 激酶信號轉導與轉錄激活因子（JAK-STAT）信號通路相關[19]。六月雪系茜草科白馬骨屬植物，臨床常用于治療腎臟疾病，大量應用可以降低蛋白尿與BUN、Scr含量，作用機制可能與其能夠降低氧化應激反應、抑制腎間質纖維化相關[20]。石韋具有較好的抗炎利尿及抗氧化作用[21]。

本研究采用5/6 腎切除方法建立CRF 腎纖維化動物模型，病理結果顯示CRF 腎纖維化存在炎性細胞浸潤、腎小球萎縮、腎間質增寬的情況，生化檢測顯示Scr 和BUN 呈現升高趨勢，結合其他文獻的研究結果，能夠確定CRF 動物模型建立成功。中醫藥干預治療能夠改善模型動物CRF 腎纖維化的病理結構，減輕炎性細胞浸潤和纖維組織增生情況，降低Scr 和BUN 含量。

通過RT-PCR 和Western Blot 分析TGF-β1/Smad 通路相關指標的含量變化，結果顯示CRF 的發病與TGF-β1、Smad3 和Smad4 的激活以及Smad7 基因、蛋白含量的下調相關。二黃益腎湯能夠抑制TGF-β1、Smad3 和Smad4 的激活，進而提高Smad7 含量，通過調控TGF-β1/Smad 信號通路發揮相關的治療作用。

綜上所述，二黃益腎湯能夠保護腎臟，抑制腎臟纖維化進程，作用機制與其對TGF-β1/Smad 信號通路的調控相關，進而為健脾補腎、化濕泄濁法治療CRF 提供基礎研究支持。