基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的蔥白提取物治療非酒精性脂肪性肝病的機(jī)制研究和驗(yàn)證*

劉云，郭潔，張曼玲，時(shí)昭紅

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬武漢市第一醫(yī)院，武漢 430000）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鳎▎渭冃灾靖我约坝善溲葑兊闹拘愿窝祝∟ASH）和肝硬化[1]。NAFLD 除直接或間接通過(guò)促進(jìn)并存的其他肝病進(jìn)展，導(dǎo)致肝臟衰竭和肝細(xì)胞癌（HCC）外，還參與2 型糖尿病及動(dòng)脈硬化的發(fā)病，是導(dǎo)致慢性肝病的重要原因之一[2]。

本課題組在近10 年的臨床診療中，借張仲景“旋覆花湯”（方藥組成：旋覆花、蔥白、茜草）治療肝著通陽(yáng)通絡(luò)之意，大劑量運(yùn)用具有通陽(yáng)作用的蔥白汁對(duì)NAFLD 進(jìn)行治療，療效顯著。同時(shí)課題組進(jìn)一步與湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院共同研發(fā)出蔥白提取物（蔥白有效部位的主要成分為二烯丙基硫醚、兒茶素等）[3]，進(jìn)行長(zhǎng)期大樣本臨床研究[4]，結(jié)果表明蔥白提取物對(duì)脂肪肝患者療效顯著，且蔥白提取物療效優(yōu)于脂必妥。基于此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)蔥白進(jìn)行進(jìn)一步的挖掘與數(shù)據(jù)分析，篩選并預(yù)測(cè)出治療NAFLD 相關(guān)性最強(qiáng)的化合物及分子靶點(diǎn)，進(jìn)而運(yùn)用小分子RNA 干擾（RNAi）技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞系 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠48 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由湖北省疾病控制中心提供，合格證編號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005。293T 細(xì)胞系，購(gòu)于賽默飛公司。

1.2 藥物與試劑 蔥白提取物來(lái)自于華夏小蔥根莖，由武漢市第一醫(yī)院藥劑研究室提取，為褐色粉末狀，批號(hào)：20110902，以適量植物油調(diào)配成懸混液，控制濃度為5 g/L；大鼠高脂飼料組成為：72.1%標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，2%膽固醇（采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），10%豬油，5%蔗糖，0.5%脫氧膽酸鈉（采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），0.2%甲硫氧嘧啶（50 mg/片，采購(gòu)于北京燕京藥業(yè)有限公司）；由武漢巴菲爾生物有限公司提供空載腺病毒及過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ 共激活因子-1α（PGC-1α）RNAi 腺病毒，滴度為109 pfu/mL。

1.3 主要儀器 Sigma30 高速低溫離心機(jī)（法國(guó)，Sigma 公司），HITACHI7160 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（日本，HITACHI 公司），微量移液器（Eppendorf 公司），電泳儀電源（型號(hào)：DYY-7C，北京六一儀器廠），垂直電泳槽（型號(hào)：DYCZ-24DN，北京六一儀器廠），電轉(zhuǎn)儀（型號(hào)：DYCZ-40，北京六一儀器廠），水平搖床（型號(hào)：TS-1，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司），pH 計(jì)（型號(hào)：LP115，德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司），電子天平（型號(hào)：CPA，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；P4000 高效液相色譜儀（美國(guó)TSP 公司），二極管陳列檢測(cè)器（型號(hào)：UV6000，美國(guó)TSP 公司），實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）儀（型號(hào)：ABI7500，美國(guó)Thermo 公司）。

2 方法

2.1 蔥白有效化學(xué)成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）檢索“蔥白”所含全部化合物，同時(shí)以口服生物利用度（OD）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為閾值進(jìn)行篩選。

2.2 蔥白有效成分相關(guān)基因靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用TCMSP 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，下載蔥白所含化合物相關(guān)基因靶點(diǎn)，利用Perl 語(yǔ)言軟件（5.28 版）進(jìn)行蔥白有效化學(xué)成分相關(guān)靶點(diǎn)篩選。

2.3 NAFLD 基因靶點(diǎn)獲取 登錄GeneCards 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索“NAFLD”疾病基因并下載。

2.4 蔥白與NAFLD 的共同基因靶點(diǎn)獲取 通過(guò)R語(yǔ)言軟件（4.0.0 版）將“蔥白有效成分相關(guān)基因靶點(diǎn)”與“NAFLD 基因靶點(diǎn)”進(jìn)行映射，得到藥物與疾病相互作用的共同靶點(diǎn)并通過(guò)Venn 圖表現(xiàn)。

2.5 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白互作圖構(gòu)建 將上述步驟所得到的數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 軟件（3.8.0 版）構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)將共同靶基因上傳至String 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)，構(gòu)建出蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 生物功能與通路富集分析 通過(guò)R 語(yǔ)言軟件對(duì)蔥白治療NAFLD 疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析。

2.7 采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果 將48 只SD 雄性大鼠分為6 組，即空白組、模型組、蔥白組、空轉(zhuǎn)組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染加蔥白組，除空白組外，其余5 組大鼠均采用高脂飼料喂養(yǎng)法造模，喂養(yǎng)12 周后造模成功，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。空白組及模型組腹腔注射生理鹽水1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；蔥白組腹腔注射生理鹽水1 mL及蔥白灌胃，每日1 次；轉(zhuǎn)染組腹腔注射PGC-1αRNAi腺病毒1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；空轉(zhuǎn)組腹腔注射空載體病毒1 mL 及生理鹽水灌胃，每日1 次；轉(zhuǎn)染蔥白組腹腔注射PGC-1α RNAi 腺病毒1 mL及蔥白灌胃，每日1 次。各組操作時(shí)間固定于每日下午，共持續(xù)4 周。藥物處理4 周后處死大鼠，取出肝臟，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）及油紅O 染色，蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)肝臟組織過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ（PPARG）、PPARG 輔助活化因子A（PPARGC1A）蛋白表達(dá)，RT-PCR 法檢測(cè)肝臟組織PPARGC1A mRNA 表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蔥白和NAFLD 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.1.1 蔥白的有效成分及作用靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)，以O(shè)B＞30%、DL＞0.18 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出化合物7 個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 蔥白有效活性成分

3.1.2 蔥白和NAFLD 基因靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及可視化分析 通過(guò)GeenCards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)1 024 個(gè)，通過(guò)R 語(yǔ)言軟件得到蔥白有效成分對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)36 個(gè)，并通過(guò)R 語(yǔ)言軟件繪制Venn 圖，得到共同靶點(diǎn)16 個(gè)，見(jiàn)圖1。將上述16 個(gè)共同靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建蔥白藥物治療NAFLD 的“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖1 蔥白與NAFLD 的共同作用靶點(diǎn)Venn 圖

圖2 “活性成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.3 蔥白治療NAFLD 的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 將蔥白及NAFLD 的16 個(gè)共同蛋白靶點(diǎn)上傳至String 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)，設(shè)置置信度＞0.4，所得結(jié)果中存在1 個(gè)游離靶點(diǎn)蛋白，另外15 個(gè)靶點(diǎn)蛋白可形成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表蛋白靶點(diǎn)，連接線代表蛋白之間的作用關(guān)系。同時(shí)運(yùn)用R 語(yǔ)言軟件，對(duì)各個(gè)靶點(diǎn)間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖3。

圖3 蔥白治療NAFLD 相關(guān)靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)

3.1.4 蔥白治療NAFLD 的GO 功能富集分析 通過(guò)R 語(yǔ)言軟件對(duì)16 個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO 分析，設(shè)置P 值為0.05，共得到67 個(gè)功能分析條目，見(jiàn)圖4，圖中展示了前20 位功能調(diào)控條目，涉及較多的為雌激素受體結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及特異性DNA 結(jié)合直接配體調(diào)控序列、類固醇激素受體、核受體轉(zhuǎn)錄共激活活性、谷胱甘肽及寡肽結(jié)合等。3.1.5 KEGG 通路富集分析 通過(guò)R 語(yǔ)言軟件對(duì)16 個(gè)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共得到114 條通路，見(jiàn)表2，表中列舉了前30 位信號(hào)通路名稱，其中涉及NAFLD 的相關(guān)信號(hào)通路包括流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等。

表2 KEGG 通路富集

圖4 GO 富集分析柱狀圖及點(diǎn)狀圖

3.2 蔥白提取物治療NAFLD 的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 PPARGC1A RNAi 腺病毒及空載體腺病毒包裝與轉(zhuǎn)染率實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證PPPARGC1A RNAi 腺病毒構(gòu)建成功，預(yù)先在正常大鼠中進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染驗(yàn)證。應(yīng)用線性化的pBSilence1.1 質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建干擾質(zhì)粒，對(duì)干擾質(zhì)粒進(jìn)行有效性篩選后亞克隆，在293T細(xì)胞系中擴(kuò)增，濃縮病毒滴度值至109 pfu/mL 備用。應(yīng)用RT-PCR 法驗(yàn)證病毒可以knock-down 大鼠轉(zhuǎn)錄因子PPARGC1A 表達(dá)，與空白組相比，空白加轉(zhuǎn)染組大鼠PPARGC1A mRNA 的表達(dá)降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖5 PPARGC1A RNAi 腺病毒對(duì)正常大鼠肝臟PPARGC1A mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=8）

隨后在實(shí)驗(yàn)各組大鼠中進(jìn)行PGC-1α RNAi 腺病毒轉(zhuǎn)染驗(yàn)證，與空轉(zhuǎn)組比較，轉(zhuǎn)染組PPARGC1A mRNA 的表達(dá)水平降低（P＜0.01），證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。與空白組比較，模型組PGC-1α mRNA 的表達(dá)水平降低（P＜0.01），證實(shí)NAFLD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與PPARGC1A失活相關(guān)。與模型組比較，蔥白組PPARGC1A mRNA的表達(dá)水平增加（P＜0.01），轉(zhuǎn)染加蔥白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6。

圖6 PPARGC1A RNAi 腺病毒實(shí)驗(yàn)各組大鼠肝臟PPARGC1A mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=8）

3.2.2 蔥白提取物對(duì)NAFLD 大鼠肝臟PPARG、PPARGC1A 蛋白合成的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝臟的PPARG、PPARGC1A 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，蔥白組大鼠肝臟的PPARG、PPARGC1A 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與空轉(zhuǎn)組比較，轉(zhuǎn)染組大鼠PPARG、PPARGC1A 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

圖7 大鼠肝臟PPARG、PPARGC1A 蛋白的表達(dá)水平條帶圖及灰度統(tǒng)計(jì)圖（±s，n=8）

3.2.3 蔥白提取物對(duì)NAFLD 大鼠肝臟組織病理學(xué)影響 從肝臟外觀來(lái)看，空白組大鼠肝臟色澤鮮紅，表面光滑，邊緣銳利；蔥白組接近空白組，無(wú)明顯油膩狀，指壓有彈性，體積大小接近空白組；其余4 組大鼠肝臟肉眼觀察可見(jiàn)體積增大，顏色淺黃，質(zhì)軟，邊緣變鈍，表面有油膩感。

從HE 染色結(jié)果來(lái)看，空白組細(xì)胞基本無(wú)異常變化，未見(jiàn)明顯脂滴空泡；模型組、空轉(zhuǎn)組、轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染加蔥白組細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大小不等的脂滴空泡，部分肝細(xì)胞核被擠到一邊，細(xì)胞腫脹；蔥白組細(xì)胞內(nèi)脂滴少于模型組。

從油紅O 染色結(jié)果來(lái)看，空白組肝細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞核大，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅色脂滴聚集；模型組、空轉(zhuǎn)組及轉(zhuǎn)染組肝細(xì)胞邊緣欠清晰，細(xì)胞間結(jié)合欠緊密，細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大小不等的紅色脂滴，細(xì)胞發(fā)生明顯腫脹；蔥白組肝細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴數(shù)量少于模型組，轉(zhuǎn)染加蔥白組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)量介于模型組和蔥白組之間。

通過(guò)肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥及肝細(xì)胞脂肪變3 個(gè)方面進(jìn)行NAS 評(píng)分，結(jié)果顯示與空白組大鼠相比，高脂飲食造成的模型組大鼠的NAS 評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)蔥白提取物處理后的蔥白組大鼠肝臟NAS 評(píng)分有所改善（P＜0.01）；空轉(zhuǎn)組、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染加蔥白組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖8、圖9。

圖8 各組大鼠肝臟組織HE 及油紅O 染色結(jié)果

圖9 各組大鼠肝臟NAS 評(píng)分（±s，n=8）

4 討論

中醫(yī)藥治療NAFLD 從整體出發(fā)，根據(jù)患者體質(zhì)結(jié)合疾病發(fā)病原因與規(guī)律，全面調(diào)節(jié)患者氣血陰陽(yáng)失衡狀態(tài)。無(wú)論辨證論治、專法專方治療，以及名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)、中西醫(yī)結(jié)合療法、中醫(yī)多途徑、多方法治療等，在控制病因、降脂、降糖、促進(jìn)肝內(nèi)脂肪消退、減少肝細(xì)胞壞死、炎癥和纖維化等方面均取得了獨(dú)特的療效優(yōu)勢(shì)。但中醫(yī)治療NAFLD 多針對(duì)其痰、瘀、濁的證候辨證施治，對(duì)病機(jī)的研究多偏重于痰濕瘀血阻滯，而對(duì)陽(yáng)氣不通的病機(jī)認(rèn)識(shí)不夠，故仍有部分NAFLD 患者臨床療效欠佳。對(duì)于這部分患者，課題組大劑量運(yùn)用具有通陽(yáng)作用的蔥白汁進(jìn)行治療，療效顯著。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)信息技術(shù)是近幾年興起的新型數(shù)據(jù)分析技術(shù)，本研究應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)，運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘的方法并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明蔥白提取物治療NAFLD 的科學(xué)性與可行性。本研究篩選得到蔥白治療NAFLD 的兩個(gè)有效成分，山奈酚（kaempferol）與15 個(gè)基因靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)，兒茶素（catechin）與1 個(gè)基因靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)。其中kaempferol 是蔥白發(fā)揮治療作用的主要有效成分之一，研究證實(shí)kaempferol 可改善肥胖大鼠糖脂代謝，降低肥胖大鼠血糖及血脂水平[5]。

同時(shí)，GO 功能富集分析顯示，蔥白治療NAFLD主要涉及雌激素受體結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、特異性DNA 結(jié)合直接配體調(diào)控序列及核受體轉(zhuǎn)錄共激活活性等生物過(guò)程。核受體包含48 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[6]，其中過(guò)氧化物酶體增殖物受體（PPARs）是核受體超家族之一，在調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝方面起著重要的調(diào)控作用。PPARG 是PPARs 中的一員，在脂肪組織中高度表達(dá)，可加速脂肪酸的氧化和分解，并能增加胰島素敏感性，降低血糖、血脂水平[7]。目前，PPARG 受體激活劑羅格列酮在臨床上運(yùn)用廣泛，實(shí)驗(yàn)證明PPARG 上調(diào)可改善肝臟脂肪性病變[8]。通過(guò)KEGG通路富集分析，顯示炎性因子通路在NAFLD疾病發(fā)展過(guò)程中占有重要地位。同時(shí)在肝臟中PPARG可誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，發(fā)揮免疫抑制型巨噬細(xì)胞作用，減少炎性細(xì)胞因子分泌，改善肝臟免疫炎性反應(yīng)[9]。

通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)PPARGC1A 與PPARG 存在密切聯(lián)系，PPARGC1A 是一種可介導(dǎo)能量代謝的核受體輔助激活因子，通過(guò)停靠轉(zhuǎn)錄因子，如細(xì)胞核呼吸因子-1（NRF-1）、肝細(xì)胞核因子-4α（HNF-4α）以及大多數(shù)核受體超家族成員，以不同的方式與其發(fā)生分子對(duì)接，進(jìn)而調(diào)控其下游一系列基因表達(dá)，在機(jī)體的線粒體生物合成、肝糖異生、脂肪酸β氧化及氧化應(yīng)激等一系列能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，PPARGC1A 基因失活使PPARG 無(wú)法激活，減少脂肪酸β 氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性[10]。同時(shí)，下調(diào)肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（CPT）、核呼吸因子（NRF）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）的轉(zhuǎn)錄活性，減少線粒體β氧化，降低線粒體對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致脂肪酸在肝細(xì)胞堆積[11]。KEGG 通路富集分析顯示PI3K/Akt信號(hào)通路在NAFLD 糖脂代謝紊亂中具有重要作用，病理情況下Akt 磷酸化異常，導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素抵抗，不能有效抑制肝糖原輸出，PPARGC1A 表達(dá)上調(diào)可維持Akt 正常酪氨酸磷酸化，增加肝臟對(duì)胰島素的敏感性[12]。

本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PPARGC1A 與PPARG 的相關(guān)性以及蔥白提取物治療NAFLD 的可行性。因此，通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，可以預(yù)測(cè)“活性成分-靶點(diǎn)-疾病”的相互作用關(guān)系，為探索具有復(fù)雜成分的中藥治療NAFLD 的作用機(jī)制提供新的研究方法。