補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚急性毒性的性別差異研究*

于瑞麗，周雅婷，張玥，2，于英莉，2，周昆，2

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 301617）

補骨脂是豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實，為臨床常用中藥，其味辛、苦、性溫，具有補腎助陽、消風祛斑及溫脾止瀉等功效[1]。補骨脂被應(yīng)用于許多中成藥中，如二神丸、壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆等方中均含有補骨脂。然而如果補骨脂在臨床中用藥不當、過量或長期用藥也會引起肝毒性[2]、光毒性[3]、腎毒性[4]等危害。性別差異是導致藥物有效性、安全性出現(xiàn)個體差異的重要因素之一[5]。目前雖然有關(guān)于補骨脂毒性的研究報道，但對補骨脂毒性的性別差異研究還未見報道。因此，本研究對補骨脂的3 種主要成分（補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂酚）對雌雄小鼠的急性毒性作用進行比較，探討其可能存在的性別差異。

1 材料

1.1 藥物與儀器 補骨脂素和異補骨脂素（純度＞98%，批號201502）購于天津市月牙湖科技有限公司，補骨脂酚（純度＞98%，批號2018041103）購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。JA1003 電子分析天平購于上海恒平科技儀器有限公司，LT1000B 電子天平購于常熟市天量儀器有限責任公司。

1.2 動物 SPF 級ICR 小鼠，雌雄各半，4～6 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于北京華阜康生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。動物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學動物實驗中心，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自由攝食和飲水，光暗周期為12 h。實驗前12 h 禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 急性毒性實驗方法 前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素劑量為633 mg/kg 時死亡的雄性小鼠較多，并且預實驗中雄性小鼠劑量為633 mg/kg 時3 只小鼠全部死亡[6]。最終，本研究中各受試藥劑量設(shè)置為：補骨脂素組雌性組（1 125、843、633、475、356 mg/kg）、雄性組（633、475、356、267、200 mg/kg），異補骨脂素組雌性組（404、343、292、248、210 mg/kg）、雄性組（317、292、269、248、229 mg/kg），補骨脂酚組雌性組和雄性組（2 000、1 765、1 500、1 200、1 020 mg/kg）。280 只ICR 小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機分組，除補骨脂酚2 000、1 020 mg/kg 劑量組為雌雄各5 只，其他劑量組及對照組均為雌雄各10 只。給藥前，小鼠禁食不禁水12 h。對小鼠進行0.4 mL/10 g 體積灌胃給藥處理，一次性給藥。連續(xù)觀察給藥后2 周小鼠毒性反應(yīng)和死亡情況，并于給藥后的第1、3、7、14 天測量存活小鼠體質(zhì)量。

2.2 統(tǒng)計分析方法 應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計學軟件，采用Probit 回歸法計算半數(shù)致死量（LD50）、最小中毒量（LD5）數(shù)值和95%可信區(qū)間，采用GraphPad Prism 5 軟件生成生存曲線。

3 結(jié)果

3.1 補骨脂素、異補骨脂素及補骨脂酚給藥期間小鼠的行為和體質(zhì)量變化 對照組小鼠在給藥后2 周內(nèi)均活動自如，無異常，無死亡；補骨脂素、異補骨脂素及補骨脂酚給藥組小鼠偶有出現(xiàn)四肢強直、抽搐、口眼周有分泌物、心率減慢乃至死亡的現(xiàn)象。與對照組比較，補骨脂素組的雌性小鼠在給藥3 d 后，體質(zhì)量均出現(xiàn)下降，并于給藥14 d 后體質(zhì)量略有回升。雄性小鼠除了低劑量組外，體質(zhì)量均呈上升趨勢，低劑量組給藥14 d 后體質(zhì)量下降。異補骨脂素組中，雌雄小鼠的體質(zhì)量與對照組比較均降低，并于14 d 后出現(xiàn)回升，其中雌性小鼠劑量為248 mg/kg組的體質(zhì)量維持在較低水平且未見回升，而雄性各給藥組小鼠體質(zhì)量升高至正常水平。與對照組比較，補骨脂酚各給藥劑量對雌雄小鼠體質(zhì)量并無顯著影響。見圖1。

圖1 補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚給藥14 d 小鼠體質(zhì)量

3.2 補骨脂素、異補骨脂素及補骨脂酚的LD50實驗結(jié)果 補骨脂素對小鼠的急性毒性在雄性表現(xiàn)更明顯，其中356 mg/kg 時雌性小鼠的死亡率為10%，而雄性小鼠的死亡率達30%。補骨脂素雌性小鼠LD50為514.35 mg/kg，95%可信區(qū)間為422.63～602.14 mg/kg；雄性小鼠LD50為421.37 mg/kg，95%可信區(qū)間為313.81～746.14 mg/kg。見表1。

表1 補骨脂素灌胃給藥LD50 實驗結(jié)果

異補骨脂素對雌雄小鼠的急性毒性并無明顯性別差異，異補骨脂素雌性小鼠LD50為258.02mg/kg，95%可信區(qū)間為224.24～284.99 mg/kg；雄性小鼠LD50為255.26 mg/kg，95%可信區(qū)間為227.28～273.37 mg/kg。見表2。

表2 異補骨脂素灌胃給藥LD50 實驗結(jié)果

補骨脂酚對雌性和雄性小鼠急性毒性也有較大差異，在2 000 mg/kg 劑量下死亡率分別為40%、100%。補骨脂酚雌性小鼠LD50 大于2 000 mg/kg，雄性小鼠LD50為1 679.40 mg/kg，95%可信區(qū)間為1 480.00～2 189.29 mg/kg。見表3。

表3 補骨脂酚灌胃給藥LD50 實驗結(jié)果

以對數(shù)劑量為橫坐標，給藥后小鼠響應(yīng)概率為縱坐標，分別作出補骨脂素、異補骨脂素以及補骨脂酚的Probit 回歸曲線。其中補骨脂素雌性小鼠的曲線方程為Y=-17.9+2.86X，R2=0.967，雄性小鼠的曲線方程為Y=-8.14+1.35X，R2=0.866；異補骨脂素組中雌性小鼠的曲線方程為Y=-22.7+4.07X，R2=0.834，雄性小鼠的曲線方程Y=-32.47+5.86X，R2=0.924；補骨脂酚組雌性小鼠的曲線方程為Y=-16.86+2.2X，R2=0.942，雄性小鼠的曲線方程為Y=-11.61+1.52X，R2=0.998。根據(jù)公式可外推出，補骨脂素的雌性小鼠LD5為294.02 mg/kg，95%可信區(qū)間為157.44～373.55 mg/kg，而雄性小鼠LD5僅為124.04 mg/kg，95%可信區(qū)間為9.25～203.4 mg/kg。但由于置信區(qū)間較寬，兩者之間差異并無統(tǒng)計學意義，從補骨脂酚2 000 mg/kg 劑量時雌雄小鼠的生存曲線也可以看出雌雄小鼠的毒性反應(yīng)存在一定差異。見圖2。

圖2 補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的Probit 回歸曲線及補骨脂酚的生存曲線

4 討論

在實驗中對補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的給藥毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)雌雄小鼠的毒性表現(xiàn)極為相似，提示不同性別動物對藥物的毒性反應(yīng)機制可能無明顯差別。另外，無論雌性還是雄性小鼠，異補骨脂素的急性毒性都明顯強于補骨脂素和補骨脂酚，LD50和LD5遠低于后兩者。

從3 條Probit 回歸曲線可發(fā)現(xiàn)，受試藥在不同性別動物的曲線斜率不同。補骨脂素和異補骨脂素，高劑量組和低劑量組具有相反的性別差異，補骨脂素在低劑量時，雌性的耐受性強于雄性，而高劑量時雄性的耐受性相比于雌性略強；異補骨脂素在低劑量時，雄性的耐受性略強于雌性，而高劑量時雌性的耐受性強于雄性；補骨脂酚在高、中、低劑量中都表現(xiàn)為雌性的耐受性強于雄性。根據(jù)Probit回歸曲線可以計算補骨脂素給藥的LD5，并作為其最小致死量進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管補骨脂素的雌性小鼠LD50值僅高出雄性小鼠22%，但由于毒性-劑量曲線斜率差異較大，根據(jù)公式可推算雌性小鼠LD5為294.02 mg/kg，而雄性小鼠LD5僅為124.04 mg/kg，補骨脂素雌性小鼠LD5值高出雄性小鼠137%。盡管這種根據(jù)回歸曲線推算的方式不夠準確，但其結(jié)果也有一定的提示作用，該計算結(jié)果表明，雌雄動物口服補骨脂素出現(xiàn)毒性的最小劑量差異較大，在臨床使用中應(yīng)予以充分注意。

隨著臨床醫(yī)學進入精準醫(yī)療時代，性別差異在藥物研究中越來越被關(guān)注。研究表明激素水平可以影響生理狀態(tài)，從而導致藥物在吸收、蛋白結(jié)合率、分布容積及代謝方面出現(xiàn)女性與男性不同的情況[5]。雌激素與各種酶或受體的相互作用還可能減弱或增強配伍藥物的作用，甚至是毒副作用[7]。肝藥酶在藥物代謝過程中發(fā)揮重要作用，而有研究發(fā)現(xiàn)，婦女在肝臟中有更多的肝藥酶[8]。因此合理判斷性別差異對藥物療效、安全性的影響是至關(guān)重要的。補骨脂素、異補脂素和補骨脂酚是補骨脂藥材的重要活性成分[9]，這3 個成分在補骨脂的藥效和毒性中有重要作用。本實驗比較補骨脂素、異補骨脂素以及補骨脂酚急性毒性的性別差異發(fā)現(xiàn)，補骨脂素在較低劑量下的毒性存在較為明顯的性別差異，而補骨脂酚大劑量時也表現(xiàn)出一定性別差異。本研究僅研究了補骨脂急性毒性時期的性別差異，尚需進一步研究和探討其長期用藥毒性的性別差異，才可能更好地為臨床上不同性別人群合理選擇藥物劑量、減少藥物不良反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)，為提高用藥水平提供實驗依據(jù)。

5 結(jié)論

補骨脂素對雌性小鼠的LD5值高出雄性小鼠137%，盡管差異并無統(tǒng)計學意義，但仍提示補骨脂素在雄性的最小毒性劑量低于雌性，其毒性具有潛在的性別差異可能。