經典名方當歸四逆湯物質基準的關鍵質量屬性傳遞規律分析*

蔣宇航，苗家燕，劉雨涵，韓晨，羅贛，高曉燕

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029）

《古代經典名方中藥復方制劑物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》[1]明確提出，在整個經典名方研究過程中，應以浸出物、含量測定、指紋圖譜等指標，全面考察藥材-飲片-中間體-對應實物的相關性，關注對應實物制備過程中關鍵質量屬性（CQAs）的量質傳遞?！度擞盟幬镒约夹g要求國際協調委員會藥物研發指導原則》（ICHQ8）[2]中提出，藥品CQAs 是在適當的限度、范圍或分布之內的物理、化學、生物或微生物性質或特征，用以確保所需的產品質量。從藥材-飲片-傳統湯劑-物質基準-復方制劑，CQAs 貫穿于經典名方研究的整個過程。為此，進行CQAs 傳遞規律研究，有助于從可量化、可傳遞、可追溯3 個角度來構建從藥材到飲片、物質基準、制劑全過程的質量控制體系。

經典名方歷經數千年臨床檢驗，是中醫藥寶庫的精華。為了推動經典名方的開發研究，國家藥品監督管理局發布《古代經典名方目錄（第一批）》[3]，當歸四逆湯（DSD）被收錄其中。DSD 出自張仲景的《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》[4]，原文：“手足厥寒，脈細微欲絕者，當歸四逆湯主之?！比接僧敋w、桂枝（去皮）、白芍、細辛、通草、炙甘草、大棗7 味藥物組成，治療血虛寒厥證癥見陽虛欲脫、四肢厥逆、冷汗自出和脈微欲絕[5-7]。現代臨床將DSD 加減化裁后用于治療雷諾氏病[8]、痛經[9-10]、關節炎[11]、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[12]和糖尿病伴隨周圍神經病變[13]等疾病，可見DSD 具有廣泛的臨床應用基礎，開發價值極大。本研究制備15 批藥材、飲片、水煎液和對應的DSD 物質基準對應實物，進行CQAs 傳遞規律研究，以構建DSD 全過程質量控制體系，為經典名方DSD 復方制劑后續開發研究提供科學理論依據。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，購自美國Waters 公司；XP-6 型精密天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DA 超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q 超純水系統，購自美國Millipore 公司；Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機，購自賽默飛世爾科技有限公司；LC-E013S電陶爐，購自廣東順德忠臣電器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，購自鄭州長城科工貿有限公司；FD-2A 型真空冷凍干燥機，購自北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 試藥與試劑 對照品芍藥苷（批號DST191024-070）、藁本內酯（批號DST200610-007）、細辛脂素（批號DST190528-014）、甘草酸銨（批號DST190702-008）、肉桂酸（批號DST200614-045）購自成都德思特生物技術有限公司；對照品桂皮醛（批號110710-201418）購于中國食品藥品檢定研究院，上述對照品純度均＞98%。色譜純乙腈，購自賽默飛世爾科技有限公司；分析純甲醇、磷酸，購自國藥集團化學試劑有限公司；水為實驗室自制超純水。

DSD 中各藥材產地信息見開放科學（資源服務）標識碼（OSID），經前期研究確定各藥材的炮制方法，由北京康仁堂藥業有限公司提供各批次藥材和飲片。方中各味藥材經北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定分別為傘形科植物當歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根、樟科植物肉桂（Cinnamomumcassia Presl）的干燥嫩枝、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根、馬兜鈴科植物北細辛[Asarum heterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum（Maxim.）Kitag]的干燥根和根莖、木通科植物三葉木通[Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz]的干燥藤莖、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）的干燥根和根莖、鼠李科植物棗（Ziziphus jujuba Mill）的干燥成熟果實。

2 方法與結果

經典名方物質基準CQAs 包括特征圖譜、指標性成分含量和干膏率，針對以上3 個方面，本研究探索了CQAs 在DSD 物質基準制備過程中藥材-飲片-水煎液-物質基準的傳遞規律。

2.1 15 批DSD 物質基準各藥味飲片批次隨機組合方法 采用隨機數字表法對各藥味飲片批次進行隨機組合及排序，15 批DSD 物質基準的藥材混批結果見OSID。

2.2 樣品制備

2.2.1 DSD 物質基準對應實物制備 稱取15 批DSD 處方量的當歸、白芍、桂枝、細辛、木通、炙甘草、大棗（破開去核）各飲片，置于3 L 陶瓷鍋內，加1 600 mL 去離子水，置電陶爐上武火（8 檔）加熱至煮沸后轉文火（5 檔）煎煮60 min，趁熱濾過，放冷，定容至500 mL，取上述水煎液適量于4 ℃、11 410×g條件下離心20 min，精密移取100 mL 上清液，-20 ℃預凍后冷凍干燥72 h 即得DSD 物質基準對應實物。

2.2.2 DSD 物質基準供試品溶液制備 供試品溶液1：取DSD 凍干粉0.45 g，精密稱定后置于5 mL容量瓶中，加入1 倍量的30%甲醇，超聲10 min 完全溶解后定容，混勻，取適量于1.5 mL 離心管中，16 060×g、4 ℃離心20 min，取上清液用于芍藥苷、甘草酸、桂皮醛、藁本內酯和肉桂酸的含量測定以及特征圖譜研究。

供試品溶液2：取凍干粉0.90 g，精密稱定，去離子水溶解后超聲10 min，定容至10 mL 容量瓶，混勻后倒入50 mL 分液漏斗中，以等量乙酸乙酯萃取2 次，合并2 次萃取后的乙酸乙酯層溶液，80 ℃水浴揮干溶劑，甲醇定容至2 mL，取適量在16 060×g、4 ℃條件下離心20 min，后取上清液用于細辛脂素的含量測定。

2.2.3 單味藥樣品及陰性樣品溶液制備 分別稱取處方量的各飲片，按“2.2.1”項方法，分別制備各單味藥樣品溶液和缺各單味藥的陰性樣品溶液，用于特征圖譜研究。

2.3 DSD 物質基準制備過程中指標成分含量傳遞規律研究

2.3.1 DSD 處方中藥材、飲片、水煎液和物質基準中各指標成分的含量測定方法 DSD 水煎液和物質基準中各指標成分含量測定的方法前期已完成[14]。

DSD 處方中藥材、飲片中芍藥苷、細辛脂素、甘草酸銨、桂皮醛的含量測定方法依據《中華人民共和國藥典》（2020 年版）[15]，但未規定當歸中指標性成分藁本內酯和桂枝中指標性成分肉桂酸的含量測定方法，故本研究在此建立如下方法。

2.3.1.1 當歸藥材及飲片中藁本內酯含量測定方法 供試品溶液制備：分別取15 批當歸藥材和飲片粉末（過3 號篩）1.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入100%甲醇20 mL，密塞，稱定總質量，超聲40 min，放冷，再次稱定質量，100%甲醇補質量，搖勻，取適量在4 ℃下、16 060×g 條件下離心20 min，取上清液用于藁本內酯的含量測定。

色譜條件：PhenomenexLuna?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～5 min，50%A；5～17 min，50%～100%A；17～20 min，100%A。柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，檢測波長290 nm，進樣量5 μL。此色譜條件用于藁本內酯含量測定。

2.3.1.2 桂枝藥材及飲片中肉桂酸含量測定方法 供試品溶液制備：分別取15 批桂枝藥材粉末（過4 號篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定總質量，超聲30 min，放冷，再次稱定質量，用100%甲醇補質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，精密量取續濾液1 mL，100%甲醇定容至25 mL 容量瓶，搖勻后取上清液用于桂皮醛的含量測定。

色譜條件：ThermoSyncronis C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，20～29%A；10～30 min，29%A；30～32 min，29%～32%A；32～40 min，32%A；柱溫25 ℃，檢測波長275 nm，體積流量1 mL/min，進樣量10 μL。此色譜條件用于肉桂酸含量測定。

2.3.2 方法學考察 因當歸中的藁本內酯和桂枝中的肉桂酸為新增定量成分，《中華人民共和國藥典》（2020 年版）未規定其檢測方法，故優化前處理方法后進行方法學考察。

2.3.2.1 線性關系考察 取藁本內酯、肉桂酸對照品適量，精密稱定，分別加純甲醇定容至5 mL，得到4.90 mg/mL 藁本內酯和0.49 mg/mL 肉桂酸母液，稀釋系列濃度梯度進樣后以對照品溶液濃度作為橫坐標（X），以不同濃度對照品進樣所得峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到各指標成分線性回歸方程為：藁本內酯，Y=8 024.7X+163 583（r＝0.999 9）；肉桂酸Y=1.348X+6.247 3（r＝0.999 5），結果表明，兩個成分依次在153.190～2 451.000、0.984～492.000 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2.2 精密度實驗 分別取當歸和桂枝藥材，按“2.3.1”項方法制備用于藁本內酯和肉桂酸含量測定的供試品溶液，并按照對應成分的色譜條件連續進樣6 次。結果顯示藁本內酯和肉桂酸峰面積RSD均小于0.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.3 穩定性實驗 分別取當歸和桂枝藥材，按“2.3.1”項方法制備用于藁本內酯和肉桂酸含量測定的供試品溶液，并按照對應成分的色譜條件進樣，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 進樣檢測。結果顯示藁本內酯和肉桂酸峰面積RSD 均小于1.14%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.3.2.4 重復性實驗 分別取同一批次當歸和桂枝藥材6 份，按“2.3.1”項方法制備用于藁本內酯和肉桂酸含量測定的供試品溶液，并按照對應成分的色譜條件進樣。結果顯示藁本內酯和肉桂酸含量的RSD 均小于2.12%，表明該方法重復性良好。

2.3.2.5 加樣回收率實驗 按《中華人民共和國藥典》（2020 年版）規定，分別以指標成分含量的50%、100%、150%加入藁本內酯和肉桂酸對照品各3 份，按“2.3.1”項方法制備供試品溶液，上述各供試品溶液按照對應成分的色譜條件進樣。結果顯示藁本內酯和肉桂酸的平均加樣回收率分別為97.54%、96.41%，RSD 分別為3.98%、2.75%，表明該方法準確可靠。

2.3.3 DSD 處方藥味各指標成分在藥材、飲片、水煎液和物質基準中的含量測定結果 以隨行對照品溶液為對照，測定15 批DSD 中6 個指標成分的含量，結果見表1 和表2。

表1 15 批DSD 藥材和飲片中指標成分的含量 %

表2 15 批DSD 水煎液和物質基準中指標成分的含量

2.3.4 DSD 處方藥味各指標成分含量在藥材-飲片-水煎液-物質基準之間的傳遞規律 計算藥材-飲片-水煎液-物質基準中指標成分含量的轉移率，考察其傳遞規律，結果見表3 和圖1。轉移率=（w×m×5）/（W×M）×100%（w：取100 mL 水煎液凍干所得DSD物質基準中有效成分的質量分數；m：DSD 物質基準的質量；W：飲片中有效成分的質量分數；M：處方中飲片的質量）。

圖1 15 批物質基準中指標性成分平均轉移率（±s）

表3 藥材-飲片-水煎液-物質基準中指標成分含量的轉移率 %

2.4 DSD 物質基準特征圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 本研究前期已建立了DSD 物質基準特征圖譜[14]。色譜條件：Phenomenex Luna?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），洗脫條件：0～8 min，5%～10%A；8～15 min，10%～13%A；15～24 min，13%～15%A；24～30 min，15%～17%A；30～34 min，17%～20%A；34～45 min，20%～30%A；45～50 min，30%～45%A；50～65min，45%～80%A；65～67 min，80%～95%A；67～70 min，95%A。柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，檢測波長230 nm 和290 nm，進樣量10 μL。特征圖譜見圖2。

圖2 DSD 物質基準特征圖譜

對DSD 物質基準特征圖譜進行特征峰歸屬分析，共歸屬20 個特征峰。峰1、2、3、4、10、17 歸屬白芍，峰12、13、14、15、16 歸屬細辛，峰6 歸屬木通，峰5、7、8、9、11、18 歸屬甘草，峰19 歸屬桂枝，峰20歸屬當歸。經與對照品比對共指認6 個特征成分，分別是4 號峰芍藥苷、5 號峰甘草苷、11 號峰甘草酸銨、14 號峰細辛脂素、19 號峰桂皮醛、20 號峰藁本內酯。大棗在此條件下沒有色譜信息，后續將進行進一步研究。

2.4.2 精密度考察 精密度：取同一供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件，連續進樣6 次。以芍藥苷（230 nm）和桂皮醛（290 nm）為參照峰，各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性考察 重復性：平行制備同一批凍干粉（S3）供試品溶液6 份，按“2.4.1”項色譜條件進樣。以芍藥苷（230 nm）和桂皮醛（290 nm）為參照峰，各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性考察 取同一供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件，分別于制樣后0、2、4、8、12、24 h 進樣。以

芍藥苷（230 nm）和桂皮醛（290 nm）為參照峰，各特征峰在24 h 內相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 DSD 物質基準特征圖譜的測定 按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項色譜條件進行測定。將15 批物質基準樣品特征圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 年版），以S1 為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，采用中位數法，進行全譜峰匹配，計算相似度。

15 批DSD 物質基準特征圖譜疊加圖見OSID。直觀分析15 批基準樣品特征圖譜，批次間色譜峰的數量及響應值差異較?。?5 批物質基準特征圖譜與對照圖譜R 的相似度均大于0.90。

2.5 DSD 特征圖譜物質群量質傳遞規律研究

2.5.1 特征峰個數的傳遞規律研究 分別將15 批當歸藥材、桂枝藥材、白芍藥材、細辛藥材、木通藥材、甘草藥材、大棗藥材、DSD 基準樣品的特征圖譜擬合出1 張對照圖譜，通過將單味藥材的對照圖譜與基準樣品的對照圖譜進行比對，發現單味藥的特征峰均可傳遞到全方基準樣品的對照譜圖中，見圖3。白芍傳遞了6 個特征峰，細辛傳遞了5 個特征峰，木通傳遞了1 個特征峰，甘草傳遞了6 個特征峰，桂枝傳遞了1 個特征峰，當歸傳遞了1 個特征峰，大棗在此條件下沒有色譜信息。表明從藥材到物質基準特征圖譜的傳遞在特征峰個數方面是穩定的。

2.5.2 特征峰保留時間的傳遞規律研究 利用1～20 號特征峰在單味藥材、飲片、水煎液和基準樣品特征圖譜中的保留時間，按公式計算特征峰在藥材-飲片-水煎液-物質基準特征圖譜傳遞中保留時間的相對偏移量，結果見表4。由結果可知，保留時間靠后的特征峰，其相對偏移量較小，最大偏移量為0.008，在藥材-飲片-水煎液-物質基準特征圖譜傳遞中，20 個特征峰的保留時間相對偏移量平均值較小，表明特征圖譜的傳遞在特征峰的保留時間方面是穩定的。以藥材（Tb）、飲片（Ta）為例，保留時間的相對偏移量＝|Ta-Tb|/Tb。

表4 特征峰在藥材-飲片-水煎液-物質基準特征圖譜傳遞中的保留時間相對偏移量

2.5.3 特征峰相對峰面積的傳遞規律研究 對15 批DSD 處方中的藥材、飲片、水煎液和物質基準中各特征峰進行測定，以每個特征峰峰面積與該峰所屬藥味特征峰的總面積（指標性成分除外）的比值作為每個特征峰的相對峰面積。計算各藥味中特征峰的相對峰面積在藥材-飲片-水煎液-物質基準的傳遞過程中的轉移率，結果見表5。由結果可知，特征峰相對峰面積的傳遞率大部分在平均值±30%波動，表明特征圖譜能夠在藥材-飲片-水煎液-物質基準過程中穩定傳遞。其中，20 個特征峰中4（芍藥苷）、11（甘草酸銨）、14（細辛脂素）、19（桂皮醛）、20（藁本內酯）號峰為指標性成分，已對其單獨進行了含量的轉移率研究。

表5 藥材-飲片-水煎液-物質基準傳遞中各藥味特征峰的相對峰面積及轉移率

2.6 DSD 物質基準制備過程中各藥味出膏率傳遞規律研究 按“2.2”項方法制備15 批物質基準樣品，測定其干膏率，了解飲片-物質基準傳遞過程中干膏率的變化規律，根據各飲片投藥量在全方投藥量的占比以及各飲片的干膏率計算全方中各單味藥折算加和后的理論干膏率。理論干膏率（%）=∑單味藥干膏率×單味藥生藥量/全方生藥量×100%。對比理論干膏率與實際干膏率，計算傳遞率：傳遞率（%）=實際干膏率/理論干膏率×100%。

15 批DSD 物質基準實際干膏率為13.37%～16.64%，且各批次干膏率未出現平均值±30%范圍之外的離散值。物質基準的實際干膏率均低于理論干膏率，可能是各成分間的相互作用導致的，傳遞率平均值為55.16%，RSD 為6.1%，表明各批次物質基準干膏率傳遞穩定。見表6、圖4。

圖4 DSD 物質基準干膏率傳遞規律分析（±s）

表6 15 批DSD 單味藥飲片、物質基準的干膏率及傳遞率結果 %

3 討論

經典名方物質基準作為后續復方制劑生產及質量控制的參照，在研究過程中具有核心地位[16]，因此對DSD 從藥材到物質基準的量質傳遞過程進行分析，明確其質量控制指標及范圍具有重要意義。本研究以指標性成分含量、特征圖譜和干膏率3 個方面作為CQAs[17]，考察其在不同工藝單元中的傳遞，從點到面地闡明經典名方CQAs 從藥材、飲片炮制到水煎煮再到濃縮凍干的長流程制備過程中的傳遞規律，以實現對DSD 物質基準質量控制，為構建全過程質量控制體系提供數據支撐，為其復方制劑的開發提供科學依據。

3.1 指標性成分含量傳遞規律分析 在DSD 指標性成分傳遞規律研究中，發現各成分在“飲片-水煎液”過程中轉移率較低，可能是由于提取方法不同所致，藥材飲片采用《中華人民共和國藥典》方法，多為醇超聲提取，而水煎液和物質基準為水煎提取，由于溫度過高、提取溶劑為水，易造成揮發性成分損失、醇溶性成分提取不完全。芍藥苷含量在藥材、飲片、水煎液和物質基準之間的轉移率穩定，藥材-飲片有2 個批次的轉移率高于平均值的130%，可能是藥材取樣隨機性較差，導致藥材中的含量低于飲片中含量。第5、11、14 批桂皮醛在“水煎液-物質基準”傳遞率波動較大，可能是桂皮醛本身穩定性差，煎煮工藝參數的微小波動導致水煎液中桂皮醛含量發生了變化。本實驗中甘草指標性成分甘草酸在DSD 水煎液和物質基準中含量波動較大，而對比“水煎液-物質基準”轉移率均在平均值±30%，調查文獻發現[18]，甘草因產地、生長時間、采收時間、取樣部位不同都會導致成分含量的較大差異，例如根木質部的甘草酸含量普遍低于根皮部。因此考慮甘草較為復雜，不同部位成分差異大，建議在今后進行含有甘草方劑物質基準的制備時將甘草混批投料，并嚴格將飲片按部位及大小分等，以確保物質基準質量的穩定。藁本內酯在“藥材-飲片”過程中含量降低，平均轉移率為65.76%，可能與飲片的炮制工藝和飲片貯存有關，與已有文獻的研究結果一致[19]，當歸飲片中藁本內酯含量與同批次藥材相比顯著降低，而新鮮切制的當歸飲片中藁本內酯的含量與藥材相比變化并不明顯。通過以上分析可以得出，取樣的隨機性、原料藥質量的均一性以及對制備工藝參數的嚴格控制均是保證指標性成分穩定傳遞的基礎和保障。

3.2 物質基準特征圖譜傳遞規律分析 對于無法進行含量測定的特征峰，以相對峰面積轉移率為考察指標，進行了其在藥材-飲片-水煎液-物質基準中特征圖譜傳遞規律的研究。結果顯示從藥材到飲片一些特征峰的相對峰面積轉移率較大，推測為凈制去除了非藥用部位。從飲片到水煎液，9、10 和13 號特征峰峰面積轉移率較大，同時注意到歸屬到各自藥材的15、16、17 號特征峰轉移率較低，可能是因復方中多成分間的相互作用促進成分在水煎液中溶出或轉移；水煎液-物質基準之間各特征峰相對峰面積的轉移率變化浮動較小，說明凍干工藝對復方中各成分影響微小。

4 結論

本實驗制備了15 批次DSD 凍干粉作為物質基準，從特征圖譜物質群量質傳遞、指標性成分含量轉移率和干膏率轉移率3 個方面對DSD 物質基準進行CQAs 傳遞規律研究。結果表明，DSD 物質基準的特征圖譜、指標性成分含量和干膏率可在藥材-飲片-水煎液-物質基準中穩定傳遞。本研究初步構建了DSD 全過程質量控制體系，為DSD 全過程質量控制提供數據支撐，為其復方制劑的開發提供科學依據。