原發性老年肝癌患者TACE前后miR-145、CD44變化及近期療效

王朝英 徐軍 羅靖茹 林海鋒

(海南醫學院第二附屬醫院腫瘤內科，海南 海口 570311)

原發性肝癌(PHC)是由肝細胞或肝內膽管細胞發生的癌腫，病死率較高，是我國常見的惡性腫瘤之一〔1〕。目前肝動脈化療栓塞術(TACE)是臨床上PHC中晚期患者，尤其是年老體弱無法耐受手術患者的首選治療方法，該法可阻斷腫瘤的血供，從而達到抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡的目的〔2〕。但腫瘤在TACE術后短期內的復發率較高，同時化療藥物和栓塞劑造成的血供不足會損傷患者的正常組織，并使肝纖維化程度增加，預后較差〔3〕。因此尋求安全有效的生物標志物對老年PHC患者TACE近期療效進行預測，有利于臨床針對患者病情情況展開進一步治療。近年來研究〔4，5〕發現，微小RNA(miRNA)與細胞生長、發育、組織分化等密切相關，其中miR-145在多種惡性腫瘤中發揮抑癌作用，對腫瘤的發生發展起著重要的調節作用，同時miR-145可能對CD44的表達有調控作用，從而影響CD44陽性的肝癌細胞增殖。CD44是存在于多種細胞膜上的一種跨膜蛋白，作為腫瘤標志物之一，CD44與人類癌癥及淋巴瘤細胞的浸潤、轉移有關，且CD44表達陽性的腫瘤細胞具有干細胞特征〔6〕。但目前miR-145、CD44在預測老年PHC患者TACE近期療效方面的相關研究較少，故本研究通過分析TACE術前、術后老年PHC患者miR-145、CD44的表達情況，探討了miR-145、CD44對TACE近期療效的預測作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年2月至2021年5月于海南醫學院第二附屬醫院接受TACE治療的老年PHC患者110例。納入標準：①PHC符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》〔7〕中的診斷標準，并經影像學檢查、病理檢查確診；②既往無手術、放化療、消融等治療史，且首次行TACE；③肝功能Child-Pugh分級〔8〕為A、B級；④預計生存期>3個月；⑤美國東部腫瘤協作組(ECOG)體力狀況評分〔9〕0～2分；⑥患者及其家屬均已簽署知情同意書。排除標準：①合并TACE禁忌證，包括明顯腹水、肝癌體積>肝臟的70%、凝血功能障礙、門靜脈高壓伴中度以上胃底食管靜脈曲張、碘過敏、動脈硬化、完全門靜脈癌栓阻塞、嚴重肝硬化門靜脈高；②無法完成選擇性肝動脈插管者；③合并其他部位惡性腫瘤者或已發生淋巴結及遠處轉移；④合并代謝性疾病或心、肝、腎功能不全等嚴重器質性疾病。本研究在實施前已獲得醫院倫理批準。

1.2方法

1.2.1TACE治療方法 患者取仰臥位，局部消毒麻醉后，采用Seldinger技術經皮穿刺股動脈(穿刺點為腹股溝韌帶下1.0～1.5 cm股動脈搏動明顯處)，以診斷性肝動脈造影明確腫瘤位置、數量、直徑及供血情況，置入導管鞘，在X線透視及減影血管造影(DSA)造影的引導下，以導絲導管法選擇性插管至腫瘤的供血動脈。化療藥物與適量超液化碘油(≤20 ml)充分混合后作為栓塞劑經導管緩慢注入，注射藥物時間≥20 min，最后退出導管，局部加壓包扎止血。術后進行常規鎮痛、保肝、止吐、預防感染等治療。

1.2.2miR-145的檢測 采集患者TACE術前及術后3 d凌晨外周空腹肘靜脈血3～5 ml，經3 000 r/min、4℃離心10 min后收集上層血清2 ml，加入Trizol總RNA提取劑(RNA快速提取試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司)，震蕩混勻后室溫靜置5 min，加入0.2 ml氯仿，震蕩靜置后離心15 min，吸取上清至滅菌離心管中，加入0.5 ml異丙醇離心10 min，去上清，加入75%乙醇1 ml，混勻后離心5 min，去上清，空氣干燥5～10 min，加入焦碳酸二乙酯水20 μl，混勻后分裝，于-80℃冰箱保存待測。采用一步法逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)將樣本總RNA逆轉錄為cDNA(RT-PCR試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司)，設計U6為內參基因(上海恒斐生物科技有限公司)，miR-145上游引物序列：5′-GCCATTAGCGCCAATTGGCAAT-3′，下游：5′-CTTAGGAATTTCCGAATCTGCC-3′；U6上游：5′-TGGCCATGGGTCTTCATAACTG-3′，下游：5′-GGCAATCCTAAGCGTTACCGA-3′。以實時定量PCR法檢測miR-145，總反應體系為20 μl，反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性11 s，60℃退火28 s，共40個循環。miR-145的相對表達量以ΔCt值表示，ΔCt=CtmiR-145-CtU6。

1.2.3CD44的檢測 采集患者TACE術前及術后3 d凌晨外周抗凝血2 ml，加等體積的0.9% NaCl溶液稀釋，將稀釋血液平鋪到3 ml淋巴細胞分離液上，兩液界面清晰，室溫下離心(800 r/min)30 min后明顯分層，吸取淋巴細胞層至潔凈離心管，以0.9% NaCl溶液洗滌重懸后離心(250 r/min)10 min，棄上清，加10 ml細胞緩沖液，離心(350 r/min)5 min后棄上清液。計數活細胞以1×106個/ml重懸于細胞染色緩沖液中，于細胞體系內加入5 μl CD44-APC綴合抗體(美國Biolegend公司)，避光冰上15 min，離心(350 r/min)5 min，以2 ml細胞緩沖液洗滌2次。FACS Calibur流式細胞儀(美國Bector Dickinson公司)采集1×104個細胞，計算CD44陽性細胞比率。CD44陽性細胞(%)=(管內CD44陽性細胞數-對照抗體陽性細胞數)/10 000個腫瘤細胞×100%。

1.2.4療效評價及分組〔10〕TACE治療后3個月，根據改良實體瘤療效評價標準(mRECIST)評估肝癌療效，完全緩解(CR)：所有目標病灶動脈期無增強顯影；部分緩解(PR)：目標病灶(動脈期增強顯影)的直徑總和縮小≥30%；進展(PD)：目標病灶(動脈期增強顯影)的直徑總和增加≥20%或出現新病灶；穩定(SD)：目標病灶的直徑縮小總和未達PR或增加未達PD；客觀緩解率(ORR)=(CR+PR)/總例數；臨床獲益率(CBR)=(CR+PR+SD)/總例數×100%。將CR、PR、SD患者納入療效良好組，PD患者納入療效不良組。

1.2.5收集可能影響TACE近期療效的相關因素 收集患者的臨床資料，包括性別、年齡、ECOG評分、Child-Pugh分級、臨床分期〔11〕、乙型肝炎E抗原(HbeAg)狀態、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤數目、包膜完整性、超選擇栓塞腫瘤供血支、門靜脈癌栓、術中碘油用量、聯合治療方案(消融、放療、分子靶向藥物治療)、化療藥物(5-氟尿嘧啶、表阿霉素、絲裂霉素)血清甲胎蛋白(AFP)水平、血清miR-145相對表達量、CD44陽性細胞比率。

1.3統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行t、χ2檢驗、Logistic回歸分析，并繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評估miR-145、CD44對老年PHC患者TACE近期療效的預測效能，計算曲線下面積(AUC)值。

2 結 果

2.1TACE術前后miR-145、CD44的表達情況 與TACE術前比較，TACE術后患者miR-145相對表達量明顯升高，CD44陽性細胞比率明顯降低(均P<0.001)。見表1。

2.2TACE術后3個月的近期療效 首次治療3個月后，110例患者中CR 3例(2.73%)，PR 61例(55.45%)，PD 22例(20.00%)，SD 24例(21.82%)，ORR為58.18%(64/110)，CBR為80.00%(88/110)；療效良好組88例，療效不良組22例。

表1 TACE術前、術后miR-145、CD44的表達

2.3單因素分析可能影響患者TACE術后近期療效的相關因素 與療效良好組比較，療效不良組包膜不完整、未超選擇栓塞供血支、門靜脈癌栓占比、腫瘤直徑及TACE術后CD44陽性細胞比率明顯升高，療效不良組TACE術后miR-145相對表達量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 可能影響患者TACE術后近期療效的相關因素〔n(%)〕

2.4Logistic回歸分析影響患者術后近期療效的相關因素 TACE術后CD44陽性細胞比率、未超選擇栓塞供血支及門靜脈癌栓是影響老年PHC患者TACE近期療效的危險因素，TACE術后miR-145相對表達量是影響老年PHC患者TACE近期療效的保護因素(P<0.05)。見表3。

2.5ROC分析miR-145、CD44對老年PHC患者TACE近期療效的預測作用 miR-145聯合CD44預測老年PHC患者TACE近期療效的靈敏度、準確度均高于miR-145、CD44單獨預測。見表4、圖1。

表3 Logistic回歸分析影響患者術后近期療效的相關因素

表4 ROC分析miR-145、CD44對老年PHC患者TACE近期療效的預測作用

圖1 miR-145、CD44預測老年PHC患者TACE近期療效的ROC曲線

3 討 論

目前臨床上治療PHC的非手術方法主要包括TACE術、放化療、射頻消融、微波等，其中TACE術以其療效佳、耐受性高的特點被中晚期PHC患者尤其是老年患者所接受，廣泛應用于PHC的治療中〔12〕。TACE術主要通過栓塞腫瘤的供血動脈，使腫瘤組織缺血壞死，進而發揮抑制腫瘤生長的作用，但化療栓塞后腫瘤易形成新的側支循環，短期內易復發，影響臨床療效和轉歸，同時肝臟正常組織可由于栓塞劑和化療藥物的沉積而發生損傷，導致肝功能受損〔13，14〕。故此，采用合適的標志物預測老年PHC患者TACE術的近期療效是臨床治療PHC的重點。

隨著分子生物技術的發展，miRNA的多種生物學功能被逐漸發掘，其可通過調控細胞分化和凋亡直接參與腫瘤的發生和發展，同時miRNA在腫瘤中可以發揮促癌基因或抑癌基因的作用〔15〕。有研究〔16〕發現，miR-145在結直腸癌、肺癌、食管癌等多種腫瘤組織中存在差異性表達，且外周血miR-145的表達量與食管癌的近期療效呈正相關。Zeng等〔17〕通過研究miR-145在胃癌中的作用機制發現，miR-145可靶向調控CD44的3′-非翻譯區，從而在抑制腫瘤生長和化療耐藥中起關鍵作用。近年來研究〔18〕發現，CD44在人類惡性腫瘤組織中普遍存在，人類CD44基因位于11號染色體短臂，其作為跨膜蛋白可與胞外基質中的透明質酸、膠原、層黏連蛋白等基質分子結合，參與腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的黏附，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。胡榆雪等〔19〕一項薈萃分析提示，CD44陽性表達與肝癌患者預后密切相關。

本研究說明老年PHC患者TACE療效較好，TACE術前、術后miR-145與CD44均有顯著變化。邢愛麗等〔20〕分析影響大肝癌患者TACE療效的相關因素發現，合并門靜脈癌栓、腫瘤包膜不完整及腫瘤位于危險部位是影響治療效果的獨立危險因素。本研究Logistic回歸分析結果表明TACE中未超選擇栓塞供血支、存在門靜脈癌栓及CD44陽性細胞比率高的患者，近期療效較差，而miR-145相對表達量較高的患者，近期療效較好。此外，ROC分析結果提示miR-145、CD44在老年PHC患者TACE近期療效的預測中有重要意義，二者聯合檢測可作為臨床預測TACE近期療效的指標。