miR-550a-5p在中老年肺癌骨轉移患者外周血中表達水平及其對肺癌細胞遷移能力的影響

荊湛 魏巍

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院骨外二科，黑龍江 佳木斯 154002)

2020年全球肺癌新發(fā)病例數約為220萬，死亡病例數約為180萬，肺癌是全球癌癥致死的首位原因，占癌癥致死總數的18%〔1〕。按照病理特征的不同肺癌可以分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌發(fā)病率高，占90%以上，小細胞肺癌發(fā)生轉移的比例更高，預后更差〔2〕。目前可用于治療肺癌的方式很多，包括放化療、手術治療、靶向治療等，但是其5年生存率仍然低于20%〔3〕。因此尋找肺癌骨轉移早期診斷的生物標志物對早期診斷肺癌骨轉移尤為重要。小分子非編碼RNA(miRNA)，長度為17～25 bp，其異常表達與許多癌癥相關，如肺癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等〔4～7〕。miRNA的作用主要是調節(jié)靶基因，是相應靶基因的上游因子，故它有可能成為早期癌癥診斷的生物標志物和治療靶點。本文通過基因表達數據集GEO2R數據分析GSE47056芯片結果，篩選出特異性高表達的miR-550a-5p，通過體內體外實驗驗證其在老年性肺癌骨轉移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取佳木斯市腫瘤結核醫(yī)院與佳木斯大學附屬第一醫(yī)院2019年10月至2021年10月臨床病理確診為肺癌的中老年患者101例。納入標準:①均經病理證實為肺癌，年齡不低于50歲；②術前未行放、化療等抗腫瘤治療；③臨床資料、隨訪資料完整。排除標準:①伴有其他原發(fā)性惡性腫瘤；②伴心、肝、腎等重要臟器嚴重衰竭者;③伴自身免疫性疾病者;④伴精神疾病者。年齡50～89歲，中位年齡67歲；病理類型:小細胞肺癌26例，腺癌50例，鱗癌24例，其他1例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期59例，Ⅲ～Ⅳ期42例。另外以本實驗室同學作為健康對照，其中女6例，男6例，年齡21～35歲，中位年齡25歲。本研究經醫(yī)學倫理委員會批準，受試者簽署知情同意書。

1.2研究方法與檢測指標 采用血常規(guī)收集管取患者外周血2 ml，1 000 r/min離心15 min，分離血清250 μl置于1.5 ml無RNA酶離心管內，標記并置于-80℃低溫保存，采用試劑盒成批提取miRNA。采用柱式 miRNA 抽提試劑盒(購自上海生工生物公司)提取，使用加尾法反轉錄miRNA，通過miRNA增強型第一鏈合成cDNA試劑盒(購自北京天根生物公司)合成cDNA。按染料法熒光定量PCR試劑盒(購自北京天根生物公司)擴增檢測。miR-550a-5p引物序列為：上游引物：5′-AGTGCCTGAGGGAGTAAGAGCCC-3′；U6作為內參，引物序列為：上游引物：5′-ATGGACTATCATA TGCTTACCGTA -3′，下游引物為反轉錄試劑盒下游通用引物。反應體系：2×miRNA qPCR master mix 10 μl；上下游引物各0.5 μl；cDNA 2 μl；ROX Reference Dye(H)1 μl；無RNA酶水6 μl；熒光定量 PCR儀檢測。每樣本平行3次實驗重復。根據CT值進行對數(2-△△Ct) 計算。

1.3體外驗證miR-550a-5p作用 A549細胞株由本實驗室保存。37℃，5%CO2條件下90%DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清(購自碧云天生物公司)培養(yǎng)細胞，收集指數生長期細胞，常規(guī)0.25%胰蛋白酶消化，計數，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌離心，試劑盒提取miRNA。檢測方法同上。

1.4劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 將指數生長期的細胞，以1×105個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，脂質體包被miR-550a-5p與NC分別轉染細胞(A549-miR-550a-5p組及A549-NC組)待細胞長滿時，用槍頭劃痕，PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0 h與12 h測量細胞劃痕愈合情況并拍照。以細胞劃痕愈合百分比表示細胞運動能力(0 h的細胞劃痕愈合為0%)。

1.5Transwell 檢測細胞遷移能力 將指數生長期的A549-miR-550a-5p組及A549-NC組細胞常規(guī)消化，無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞濃度至5×105個/ml，上室加入細胞懸液200 μl，下室加入含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基900 μl，14 h后取出小室，干棉簽拭去內表面細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結晶紫染色15 min，清洗，晾干，每組3個小室，每個小室選5個視野拍照并計數。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行數據分析，符合方差齊的正態(tài)分布采用非配對獨立樣本t檢驗；符合方差不齊的正態(tài)分布采用韋爾奇t檢驗；數據不符合正態(tài)分布運用曼-惠特尼軼和檢驗。應用GraphPad Prism8.0統(tǒng)計軟件進行受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-550a-5p對肺癌及肺癌骨轉移的診斷價值進行評估。

2 結 果

2.1肺原位癌與骨轉移血清中miR-550a-5p的差異分析與驗證 將GSE47056數據集中的表達矩陣導入GEO2R工具，分組后進行差異分析。差異分析結果顯示，全部基因差異分析的火山圖。見圖1。其中，以miR-550a-5p為首的18個基因的表達量呈現(xiàn)顯著上調，選擇差異顯著的miR-550a-5p進行差異表達驗證及研究。

綠色代表下調差異基因，紅色代表上調差異基因圖1 肺癌高轉移A549細胞株與低轉移細胞株miRNA差異分析火山

2.2肺原位癌與骨轉移血清miR-550a-5p與臨床病理特征 肺原位癌患者外周血miR-550a-5p表達(0.157 2±0.021)高于正常人(0.140 3±0.011)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；肺癌骨轉移患者(n=49)miR-550a-5p(0.201 9±0.015)顯著高于原位癌(n=52,P<0.05)。miR-550a-5p與性別、吸煙史、腫瘤直徑不相關，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與腫瘤病理分型相關(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特性患者miR-550a-5p表達比較

2.3肺原位癌與骨轉移血清中miR-550a-5p臨床診斷骨轉移價值分析 miR-550a-5p用于診斷肺癌骨轉移患者，曲線下面積為0.684，95%置信區(qū)間為：(0.540～0.829)，靈敏度為76.19%，特異性為60.00%。見圖2。

2.4miR-550a-5p促進A549遷移能力驗證 與A549-NC組比較，A549-miR-550a-5p組劃痕愈合率顯著降低，穿膜細胞數顯著增多(P<0.05,P<0.01)。見圖3，表2、圖4。

圖2 血清miR-550a-5p診斷肺癌骨轉移ROC曲線

圖3 Transwell實驗檢測miR-550a-5p對A549細胞遷移能力影響(結晶紫染色，×100)

表2 兩組劃痕愈合率和穿膜細胞數比較

圖4 劃痕愈合實驗檢測miR-550a-5p對A549細胞遷移能力影響(×100)

3 討 論

肺癌的治療手段雖然日漸完善，但由于早期癥狀不明顯，肺癌確診時部分腫瘤已有區(qū)域轉移擴展或遠處轉移。肺癌與前列腺癌、乳腺癌并稱三大最易發(fā)骨轉移癌癥，會出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴重影響患者生存率與生活質量。老年性肺癌在肺癌患者中比例較高，是否出現(xiàn)轉移是選擇治療方案的重要考慮因素。目前診斷肺癌骨轉移通常采用放射性核素骨掃描、發(fā)射型計算機斷層掃描(ECT)、磁共振成像(MRI)等，但由于敏感度與特異度原因，難以實現(xiàn)骨轉移早期診斷目的。骨組織活檢是診斷骨轉移的金標準，但由于身體狀態(tài)等客觀原因，有很多患者不會選擇組織活檢診斷。因此尋找肺癌骨轉移的特異性生物標志物是目前研究熱點。雖然診斷骨轉移的特異性miRNA尚未有臨床應用，但由于miRNA對腫瘤轉化、良性和惡性腫瘤進展的特異性調節(jié)具有重要意義，并且miRNA存在于所有組織及血液中，在外周血中的miRNA由于有外泌體的包裹，其表達量穩(wěn)定，不易降解，是具有廣泛應用前景的生物標志物。

本文通過GEO數據庫篩選發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p在高轉移能力與低轉移能力肺癌之間表達差異明顯。經體外實驗驗證，將miR-550a-5p轉染到肺癌細胞株A549中觀察其對細胞的影響，也發(fā)現(xiàn)高表達miR-550a-5p導致細胞遷移侵襲能力增強，具有促癌轉移惡性生物學行為能力。Guo等〔8〕、Meng等〔9〕發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p作為促癌因子在肺腺癌患者中高表達，與患者的生存率呈反比，在乳腺癌中也表現(xiàn)出相同趨勢，說明其作用明確穩(wěn)定，檢測重復性好。Heilmeier等〔10〕發(fā)現(xiàn)在糖尿病病理骨折與絕經后骨質疏松性骨折的患者中miR-550a-5p表達明顯升高，體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-550a-5p可以抑制成骨，說明miR-550a-5p在病理性骨折中發(fā)揮重要調節(jié)作用。

綜上，miR-550a-5p既具有促腫瘤細胞遷移能力又具有抑制成骨反應能力，是腫瘤骨轉移的潛在生物因子。如果可作為診斷腫瘤骨轉移的分子標志物，將會為骨轉移癌患者早期診斷提供極大方便。