參紅通絡方調控巨噬細胞極化防治動脈粥樣硬化機制

石妍玉 曲婉彤 張澤鵬 陳穎

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2長春中醫藥大學附屬醫院心病中心)

動脈粥樣硬化(AS)是由脂質蓄積引發的慢性動脈血管壁炎癥性疾病，是心血管疾病的主要病理學基礎。目前我國約有 3.30 億心血管病患者〔1〕，已經成為城鄉居民的第一位死因，是我國面臨的重大公共衛生問題，因此干預AS迫在眉睫。巨噬細胞在AS的發生發展過程中具有至關重要的作用〔2〕。巨噬細胞可分為經典活化的M1型、選擇性活化的M2型。研究發現，可通過抑制M1型巨噬細胞極化，促進M2型巨噬細胞極化，延緩AS斑塊形成〔3〕。AS的關鍵病機是“痰瘀伏絡”，本研究因而創立了以益氣化瘀、豁痰通絡解毒為核心治法的參紅通絡方。既往研究表明參紅通絡方〔4，5〕能夠縮小斑塊面積，降低斑塊內凋亡細胞指數，抑制巨噬細胞炎癥因子的活化而實現對AS斑塊周圍炎癥的控制，但其具體作用機制尚未完全明確。鑒于巨噬細胞發生極化后可調控炎癥因子的活化，對介導炎癥的發生與發展具有重要作用。因此，本研究通過檢驗參紅通絡方對AS模型小鼠巨噬細胞極化的影響，探討該方防治AS的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇健康雄性ApoE-/-小鼠及C57BL/6小鼠，SPF級，6周齡，每組各10只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011，于長春中醫藥大學動物實驗中心二層SPF級小鼠飼養室中飼養。動物照明時間8∶00～20∶00，晝夜交替12 h/12 h，溫度為(22±2)℃，濕度為45%～70%。本實驗由長春中醫藥大學動物實驗倫理委員會審核通過，批準編號20190048。

1.2主要試劑及儀器 人參、丹參、紅景天、金銀花、赤芍、瓜蔞、當歸、降香購自長春中醫藥大學附屬醫院藥房；油紅染夜、蘇木素染液、伊紅染液、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑、RIPA裂解液購自Servicebio；兔抗分化簇86(CD86)、甘露糖受體(CD206)、一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(Arg)1及鼠抗β-actin等抗體購于英國Abcam 公司。Donatello脫水機及Giotto染色機(DIAPATH)；D1008E掌上離心機、G6004載玻片；D3024R臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB)；E100顯微鏡(Nikon)；-80℃超低溫冰箱和高壓濕熱滅菌鍋(Sanyo)。

1.3飼料制備 普通維持飼料購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，批號：SCXK(遼)2018-0001；高脂飼料(40 kCal%脂肪,1.25%膽固醇,0.5%膽酸)購自Research Diets公司，型號為D12109C。

1.4動物分組、造模及給藥 40只ApoE-/-小鼠按照隨機數字表法分為模型組、參紅通絡方低、中、高劑量組，取遺傳基因相同的C57BL/6小鼠10只為空白對照組，適應性喂養1 w后，按照組別分別給予高脂飼料或普通飼料喂養7 w后，除空白對照組外，各組隨機抽取1只，取主動脈整體及主動脈竇進行大體油紅O染色及蘇木素-伊紅(HE)染色，以觀察造模情況。造模成功后，治療組分別給予參紅通絡9、18、36 g/kg每日灌胃給藥，給予模型組、空白對照組小鼠等量生理鹽水灌胃，持續8 w后，小鼠禁食12 h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后取小鼠主動脈，剪下連有心臟的部分胸段主動脈。

1.5檢測指標 ①大體油紅O染色觀察小鼠主動脈整體的斑塊形成情況。將目的區域的血管分離，盡可能去除脂肪組織，組織經過固定、剖開、染色后，鏡下觀察并拍照留存。結果判讀：脂滴呈橘紅色或鮮紅色。②HE染色觀察小鼠主動脈竇的斑塊形成情況。取小鼠主動脈使用生理鹽水浸洗，放入4%多聚甲醛，固定過夜，清洗，脫水，放入石蠟溶液中包埋，冷卻凝固后將蠟塊連續切取厚度4 μm的組織切片，然后依次進行貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片后拍照留存。③免疫組化(IHC)法檢測CD86、CD206的表達水平。將石蠟切片使用檸檬酸鹽修復液95℃修復后，血清封閉，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，各步驟間磷酸鹽緩沖液(PBS)4 min×5次充分洗滌，蘇木素復染6 min，脫水、透明、封片，使用顯微鏡觀察并拍照留存。④Western印跡法檢測小鼠主動脈組織中iNOS、Arg-1蛋白的表達水平。提取組織蛋白并蛋白定量后，準備電泳，轉膜，加脫脂牛奶，按說明書加一抗稀釋、加入三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水與補間(TBST)，將二抗稀釋、孵育，而后洗脫，全部完成后進行化學發光，分析凝膠圖像，用Image-Pro Plus6.0軟件分析目標帶的光密度值。

1.6統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1參紅通絡方對小鼠主動脈整體斑塊形成的影響 如圖1所示，可以觀察到空白對照組主動脈整體無明顯斑塊的形成；模型組主動脈整體有明顯紅色斑塊形成；與模型組相比，參紅通絡方低、中、高劑量組小鼠主動脈整體紅色斑塊面積均有不同程度的減少。定量分析結果顯示，模型組主動脈整體平均斑塊占比為(44.25±5.18)%，參紅通絡低、中、高劑量組主動脈平均斑塊占比分別為(30.58±3.26)%、(24.61±4.13)% 和(28.59±1.72)%，與模型組比較顯著降低(P<0.05)；參紅通絡中劑量組主動脈整體斑塊占比最低，與參紅通絡低劑量組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 各組主動脈血管大體油紅O染色結果

2.2參紅通絡方對小鼠主動脈根部斑塊形成的影響 如圖2，空白對照組小鼠主動脈內壁邊緣整齊，結構清晰，無斑塊；模型組小鼠主動脈內壁可見明顯斑塊凸起，壞死核心形成。與模型組相比，參紅通絡方各劑量組均呈現不同程度的改善。定量分析結果顯示，模型組主動脈竇斑塊占比達(55.13±9.81)%；參紅通絡低、中、高劑量組斑塊占比分別為(43.20±2.22)%、(31.08±5.25)%和(33.98±5.06)%，與模型組比較顯著降低(P<0.05)。

2.3參紅通絡方對CD86、CD206的表達水平的影響 如圖3，與空白對照組相比，模型組主動脈組織中CD86含量顯著升高(P<0.01)，而CD206 含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，參紅通絡方低、中、高劑量組主動脈組織中CD86含量均顯著降低(P<0.05)，而CD206含量均升高(P<0.05)。與參紅通絡方低劑量組相比，參紅通絡方中劑量組提高CD206表達水平的效果最佳，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3、表1。

圖2 各組主動脈根部HE染色(×160)

圖3 各組主動脈組織CD86、CD206表達(IHC，大圖×160，右下角圖×480)

表1 各組主動脈組織CD86、CD206的表達情況

2.4參紅通絡對iNOS、Arg-1蛋白表達水平的影響 與空白對照組相比，模型組主動脈組織中iNOS蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，而Arg-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，參紅通絡低、中、高劑量組主動脈組織中iNOS蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，Arg-1蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)。參紅通絡中劑量組提高Arg-1蛋白表達水平的效果最好，與參紅通絡低劑量組相比有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表2。

1～5:空白對照組，模型組，參紅通絡低劑量組，參紅通絡中劑量組，參紅通絡高劑量組圖4 各組主動脈組織iNOS和Arg-1的蛋白表達

表2 各組主動脈組織iNOS、Arg-1表達比較

3 討 論

中醫根據癥狀及體征把AS歸為“瘀證”“脈痹”“胸痹”等疾病范圍。中醫認為AS是由很多因素造成，其主要成因與飲食不當、情志失調、年老體弱、外邪侵襲等密切相關，其病機為氣、血、津液紊亂，臟腑功能失調而形成痰、飲、瘀、毒，多屬本虛標實，虛實夾雜之證，本虛為氣虛、陰虛、陽虛，標實則為痰濁、血瘀、熱毒〔6〕。國醫大師任繼學教授認為伏邪具有“邪伏虛處，待時而發，反復發作，不易去除”的特點，是慢性疾病的共同病因〔7〕，認為“痰瘀伏絡”是AS的核心病機。因此，參紅通絡方由人參、丹參，紅景天、金銀花、赤芍、瓜蔞、當歸、降香等8味中藥配伍組成，其中人參以健脾補肺，丹參以補血活血，紅景天以活血通絡，金銀花以清熱解毒，赤芍以行血活血，瓜蔞以清熱化痰，當歸以祛瘀止痛，降香以緩急止痛，共同達到益氣化瘀、豁痰通絡解毒的功效。根據現代藥理學研究，人參皂苷Rb〔8〕可促進白細胞介素(IL)-4和IL-3的分泌，使信號轉導及轉錄激活蛋白(STAT)6發生磷酸化，促進M2巨噬細胞極化，從而發揮抗AS的作用，丹參酮ⅡA〔9〕能夠促使M2型細胞分泌抗炎因子,抑制M1型細胞分泌促炎因子,從而達到抗AS作用，紅景天苷〔10〕可能通過調節血脂代謝、調整巨噬細胞M1/M2分型極化達到抑制炎癥反應、穩定斑塊的作用，金銀花〔11〕主要的有效藥理成分是綠原酸，綠原酸通過抑制炎癥反應及脂質堆積來發揮抗AS的作用，赤芍總苷〔12〕通過抑制心肌細胞凋亡、 清除氧自由基等作用來抗AS，瓜蔞〔13〕主要成分為皂苷及氨基酸，具有擴張動脈，營養心肌等作用，當歸可以增加心肌細胞的血流量，抗血栓形成，抑制血小板聚集，降香〔14〕能夠調節脂肪酸氧化與糖代謝，維持心肌能量代謝平衡，從而保護心肌。

AS是臨床上一種累及大、中動脈的炎癥性疾病。在AS血液循環中，單核細胞遷移到動脈易損部位并黏附到活化的內皮細胞及內皮細胞間隙中，在局部產生趨化因子遷移到內膜下層，轉變為巨噬細胞，之后，一些炎癥介質誘導巨噬細胞表面表達清道夫受體，使巨噬細胞大量吞噬氧化修飾的脂蛋白形成泡沫細胞，脂質負荷的泡沫細胞死亡，形成壞死脂質核心，其上覆蓋平滑肌細胞分泌的基質蛋白質形成的纖維帽，形成AS斑塊〔15〕。本研究結果顯示，參紅通絡方能夠有效抑制主動脈整體及主動脈竇斑塊形成，有效減少脂質堆積并減少膠原纖維的形成，抑制AS病變的進展，達到抗AS的效果。

M1型巨噬細胞大部分是由脂多糖、干擾素γ等細胞因子誘導分化，能夠高表達CD86、iNOS等，與斑塊發生、進展及斑塊不穩定息息相關。其主要原因為M1型巨噬細胞能夠分泌多種促炎因子及促炎介質，使內皮細胞損傷，促進一氧化氮等活性氧的合成，進一步加重氧化應激反應，促使細胞凋亡，加快斑塊鈣化，進而促進AS的發展。同時，M1型巨噬細胞還能夠釋放基質金屬蛋白酶，使細胞外基質的合成與分解處于失衡狀態，明顯使斑塊內纖維帽變薄，從而大大增加了斑塊的不穩定性，甚至導致斑塊破裂，從而加速了心血管不良事件的發生，而由IL-4、IL-10等細胞因子誘導分化的M2型巨噬細胞，高表達IL-1、IL-10、CD206、Arg-1等，具有吞噬、促血管生成及促進組織修復，減少炎癥反應，維持斑塊穩定，進而延緩AS的發生發展〔16，17〕。在AS不同階段，不同亞型的巨噬細胞比例一直處于動態變化當中。已有研究表明，在AS發展期，M1型和M2 型巨噬細胞的數量均增加，其中，M1型巨噬細胞主要在易損斑塊肩部聚集〔18〕，而M2 型巨噬細胞主要存在于穩定的斑塊區域中〔19〕，在AS進展期，斑塊以M1型為主，在AS消退期，斑塊以M2 型為主，因此，可以認為當斑塊處M2型巨噬細胞的數量超過M1型巨噬細胞的數量時，斑塊可能會更加穩定，不容易發生斑塊破裂現象，從而延緩了AS的發展〔20〕。本研究證實了參紅通絡方能夠有效降低M1型巨噬細胞的表達，提高M2型巨噬細胞的表達，改善巨噬細胞的極化比例，抑制血管內炎癥反應，明顯縮小斑塊面積，有效增加斑塊的穩定性，進而延緩AS進程，達到抗AS的目的。

綜上所述，參紅通絡方通過減少M1型促炎巨噬細胞的極化，增加M2型抗炎巨噬細胞極化，縮小斑塊面積，維持斑塊的穩定性，進而發揮抗AS的作用，進一步為臨床研究該方提供了新的實驗依據，但該方具體通過何種途徑干預巨噬細胞極化仍待深入研究。