miR-199a靶向調控TAB2調節內皮祖細胞抑制深靜脈血栓形成

牛帥 裴月穎 唐雷 丁殿柱

(河北省人民醫院，河北 石家莊 050000)

下肢深靜脈血栓(DVT)是指由于深靜脈內血液發生非正常凝集而引起的靜脈管腔阻塞，導致血液回流障礙而形成的一種血栓，多發于下肢〔1〕。DVT發病范圍廣，且發病原因復雜，慢性期DVT由于靜脈瓣膜功能損傷易導致血栓形成后綜合征(PTS)，而急性期DVT易并發致死性肺栓塞(PTE)，嚴重影響患者的生活質量甚至生命健康〔2，3〕。目前，溶栓治療仍是臨床上用于治療DVT的主要方法〔4〕。內皮祖細胞(EPCs)是血管內皮的前體細胞，在病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周參與損傷血管的修復，促進EPCs發揮功能有利于治療DVT〔5〕。miRNAs是廣泛存在于動植物體內的一種高度保守的內源性非編碼單鏈RNA，可參與調控細胞增殖、分化、遷移等多個生理過程〔6〕。且有研究表明相關miRNA可參與DVT的血栓溶解再通過程〔7，8〕。本研究發現DVT大鼠EPCs中miR-199a表達量異常，提示miR-199a在DVT病理過程中可能發揮重要作用，因此對miR-199a在DVT內皮祖細胞中表達和功能及其可能作用機制進行探究。

1 材料方法

1.1主要試劑 6～8周齡雄性SD大鼠及血栓模型大鼠均購自北京維通利華有限公司；DMEM低糖培養基、胎牛血清及雙抗購自Gibco公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、RNAiso試劑盒、反轉錄試劑盒等購自Takara公司；熒光標記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)試劑購自北京博蕾德科技發展有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、大鼠臟器組織淋巴細胞分離液試劑盒購自Solarbio公司；Transwell小室購自Corning公司；基質膠購自上海浩然生物技術有限公司；紅蛋白標記蛋白ACD133抗體(CD133-PE-A)、熒光素APC標記重組純化蛋白A血管內皮生長因子受體2抗體(VEGFR-2-APC-A)、異硫氰酸熒光素標記的血管內皮生長因子受體2抗體(VEGFR-2-FITC)、接頭蛋白(TAB2)抗體購自Abcam公司；RIPA裂解液、辣根過氧化物酶(HRP)標記熒光二抗、乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶購自Sigma公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)工作液購自碧云天公司；si-NC質粒、si-TAB2質粒由上海生工生物工程有限公司合成；miR-199a模擬物(mimics)、miR-199a抑制劑(inhibitor)及miR-199a激動劑(agomir)均由吉瑪基因設計合成。

1.2EPCs分離培養 參照Brice等〔9〕的分離培養方法及大鼠臟器組織淋巴細胞分離液試劑盒說明書進行EPCs的分離和培養，頸椎脫臼法處死SD大鼠后，分離雙側股骨和脛骨，用含有10%胎牛血清(FBS)的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，剪除骨骺端以暴露骨髓腔，勻漿沖洗液沖洗骨髓腔，收集含骨髓細胞的沖洗液，過濾后離心棄上清，樣本稀釋液重懸細胞備用。取6 ml組織淋巴細胞分離液于15 ml離心管中，緩慢加入細胞懸液，2 000 r/min離心30 min，離心后細胞分為三層，吸取中層細胞接種于6孔板中置于37℃，5%CO2培養箱中培養，48 h后更換為含有20% FBS的DMEM低糖培養基繼續培養。

1.3EPCs鑒定 取培養至第7天的EPCs細胞，棄去培養基，PBS清洗2次，胰酶消化后收集至15 ml離心管中，800 r/min離心10 min，棄上清，PBS沖洗3次后用100 μl重懸。將制得的細胞懸液轉入流式細胞儀的上樣管中，分別加入10 μl熒光標記的CD133-PE-A抗體和VEGFR-2-APC-A抗體，4℃避光孵育90 min加入500 μl PBS，1 500 r/min離心10 min，棄上清，300 μl標準結晶牛血清白蛋白(BSA)重懸細胞，置于流式細胞儀檢測表面抗原CD133和VEGFR-2的表達。

免疫熒光鑒定：將EPCs細胞培養于24孔板中(孔內提前放入爬片)，待細胞長滿單層的80%后進行試驗。棄去培養基，PBS洗滌3次，每次間隔5 min。每孔加入400 μl 4%多聚甲醛，室溫固定15 min。棄掉多聚甲醛，立即加入1 ml預冷的甲醇，室溫透化10 min。PBS洗滌3次，加入300 μl 5%BSA溶液，4℃過夜封閉。棄掉封閉液，加入300 μl按1∶300稀釋的VEGFR-2-FITC抗體，避光溫育1 h。棄掉抗體，每孔加入400 μl按1∶10稀釋的DAPI染料，避光作用15 min。棄掉DAPI，PBS洗滌3次，將爬片轉移至載玻片上，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.4qRT-PCR 參照RNAiso試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后以其作為模板并按照qRT-PCR試劑盒說明書進行PCR擴增反應，同時選擇U6作為內參，每個樣本均進行3次獨立重復檢測，取平均值利用2-ΔΔCt法進行統計分析。miR-199a所用引物序列〔10〕為：正義鏈：5′-TCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′；反義鏈：5′-TCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′。U6引物序列為：正義鏈：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；反義鏈：5′-TACCTYGCGAAGTGCTAAAC-3′。

1.5電穿孔轉染法 收集生長至對數期細胞，PBS清洗2次，胰酶消化細胞，完全培養基終止消化后收集至15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用轉染試劑減血清培養基(Opti-MEM)重懸細胞，制成細胞懸液并計數，調整細胞密度為4×108/L，隨機分為4組，分別為轉染miR-199a mimics組和轉染miR-199a inhibitor組及NC-mimics組和NC-inhibitor組。

miR-199a mimics組和NC-mimics組轉染：取50 μl細胞懸液，分別與10 μl miR-199a mimics和10 μl NC-mimics充分混勻，按照脈沖20 ms，電阻90 Ω，電壓150 V的條件電擊細胞。培養48 h后，通過qRT-PCR檢測轉染效率。

miR-199a inhibitor組和NC-inhibitor組轉染：方法同上，將miR-199a mimics和NC-mimics替換為miR-199a inhibitor和NC-inhibitor。

1.6Transwell試驗測定遷移能力 將Transwell小室置于24孔板上，37℃溫育。向下室中加入600 μl完全培養基，上室中分別加入100 μl無血清培養基懸浮的各組細胞，細胞密度以2×105/ml為宜。培養24 h后，取出小室，棄掉上室液體，甲醇固定30 min后吉姆薩(Giemsa)室溫染色15～30 min，PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察拍照，測定細胞遷移能力。

1.7基質膠成管試驗 試驗前24 h將基質膠置于4℃冰箱過夜，使基質膠緩慢融化。轉染的各組EPCs細胞用不含血清的培養基饑餓培養24 h后制備密度為2×105/ml的細胞懸液，取50 μl細胞懸液加入鋪有基質膠的24孔板中，培養8 h后置于顯微鏡下采集圖像，觀察血管形成情況。

1.8Western印跡 收集各組EPCs細胞，加入現配的裂解液，冰浴30 min。超聲破碎，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清測定蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，65 V恒壓電泳30 min后更換為120 V至電泳結束，恒流250 mA轉印2 h，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h。加入1∶1 000稀釋的TAB2抗體，室溫孵育4～6 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入1∶3 000稀釋的HRP標記熒光二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。在Bio-Rad膜成像系統下顯色并分析結果。

1.9熒光素酶報告試驗 按照試劑盒說明書分別擴增TAB2-WT和TAB2-MUT目的基因片段，電泳鑒定后切膠回收，根據試劑盒說明書中的酶切體系，對目的基因和連接載體進行酶切，酶切后對產物進行切膠回收。然后根據連接體系進行連接，構建含有熒光素酶報告基因標記的TAB2-WT 3′非編碼區(UTR)及TAB2-MUT 3′UTR重組質粒，參照1.5中的轉染方法將重組質粒分別轉染細胞。

將轉染TAB2-WT 3′UTR重組質粒組細胞隨機分為4組，分別再轉染miR-199a mimics、NC-mimics、miR-199a inhibitor及NC-inhibitor質粒，再進行后續試驗。棄掉細胞培養液后直接加入充分混勻的報告基因細胞裂解液以充分裂解細胞，33 334 r/min離心5 min，取上清用于測定。按照說明書配制熒光素酶檢測工作液，取100 μl裂解后細胞樣品，加入100 μl熒光素酶檢測試劑，吹打混勻后置于熒光測定儀下測定各組RLU。轉染TAB2-MUT 3′UTR重組質粒組試驗方法同上。

1.10EPCs移植 選取30只大鼠建立DVT模型，飼養至15 d后分為3組：Blank組、EPCs/vector組和EPCs/miR-199a agomir組，每組10只，移植所用的EPCs事先用VEGFR2-FITC熒光抗體對其表面VEGFR2受體進行標記。移植后14 d，將大鼠麻醉后開腹，分離其下腔靜脈，在血栓上下靜脈段夾閉血管，剖開管腔，取出血栓后置于烘箱中烘干后稱量血栓重量并做好記錄。

1.11HE染色 根據標準操作規程進行HE染色。將取下的血栓投入10%甲醛中進行固定，固定后置于包埋盒中流水沖洗30 min，置于酒精中脫水處理后再置于二甲苯中透明，之后浸蠟包埋再進行切片。將烤干的切片置于二甲苯中脫蠟10 min。依次置于100%、95%、85%、70%酒精中各2 min，移入水中3 min以洗去酒精，再移入蒸餾水中2 min。蘇木素染液染色10～15 min，洗去多余染液，置于1%鹽酸酒精中分化10 s，流水沖洗30 min。伊紅染液浸染5 min，洗去多余染液。而后依次置于70%、85%、95%、100%酒精中脫水各2 min。移入二甲苯中透明2次，時間共約10 min。擦去多余二甲苯，迅速滴加中性樹膠封片，平置晾干后進行觀察。

1.12統計學方法 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1EPCs的鑒定 培養3 d后，倒置顯微鏡下觀察EPCs形態，發現EPCs集落呈圓形，并形成中心簇(圖1A)，流式細胞儀檢測顯示第14天EPCs表達干細胞表面抗原VEGFR-2和CD133(圖1B)，免疫熒光方法檢測細胞表面標記VEGFR-2，結果顯示，絕大多數細胞表達內皮表面標志物VEGFR-2，且VEGFR-2主要表達在細胞質中(圖1C)。

A.倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(免疫熒光，×400)；B.流式細胞儀檢測第14天EPCs干細胞表面抗原VEGFR-2和CD133的表達；C.免疫熒光方法檢測EPCs表面標記VEGFR-2(×400)圖1 EPCs的鑒定

2.2miR-199a在DVT大鼠EPCs中表達 qRT-PCR檢測DVT大鼠和正常組SD大鼠分離的EPCs細胞中miR-199a表達(0.24±0.02 vs 0.98±0.05)，結果發現，miR-199a在DVT大鼠中表達顯著下調(t=33.660，P<0.05，n=6)。

2.3miR-199a促進EPCs細胞遷移和血管形成 miR-199a mimics組miR-199a表達顯著高于NC-mimics組，miR-199a inhibitor組miR-199a表達顯著低于NC-inhibitor組(P<0.05)。miR-199a mimics組遷移能力和血管形成能力顯著高于NC-mimics組，miR-199a inhibitor組遷移能力和血管形成能力顯著低于NC-inhibitor組(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

表1 miR-199a 促進 EPCs 細胞遷移、血管形成及TAB2蛋白表達比較

圖2 Transwell實驗檢測各組EPCs遷移能力(結晶紫染色，×200)

圖3 基質膠成管實驗檢測血管形成能力(×400)

2.4TAB2是miR-199a的靶基因 生信網站targetscan預測TAB2 3′UTR存在與miR-199a結合的位點(圖4)，熒光素酶報告實驗顯示，miR-199a可以與TAB2 3′UTR WT結合，顯著抑制熒光素酶活性(P<0.05)；miR-199a mimics組TAB2蛋白表達明顯低于NC-mimics組，miR-199a inhibitor組TAB2蛋白表達明顯高于NC-inhibitor組(P<0.05)。見表1、圖5。

圖4 TAB2 3′UTR存在與miR-199a結合的位點

1～4：NC-mimics組、miR-199a mimics組、NC-inhibitor組、miR-199a inhibitor組圖5 敲減或過表達miR-199a后TAB2蛋白表達

2.5miR-199a通過調控TAB2促進EPCs細胞遷移和血管形成 miR-199a in+si-TAB2組TAB2表達顯著低于miR-199a in+si-NC組(P<0.05)，遷移和血管形成能力比較，miR-199a in+si-TAB2組均顯著高于miR-199a in+si-NC組(P<0.05)。見圖6、表2、圖7、圖8。

1～3：NC組、miR-199a in+si-NC組、miR-199a in+si-TAB2組圖6 TAB2蛋白表達

表2 miR-199a 通過調控 TAB2 促進 EPCs 細胞遷移和血管形成

圖7 Transwell實驗檢測各組EPCs遷移能力(結晶紫染色，×400)

圖8 基質膠成管實驗檢測血管形成能力(×400)

2.6miR-199a調節內皮祖細胞抑制深靜脈血栓形成 EPCs移植后第7天，EPCs示蹤結果顯示，EPCs/miR-199a agomir組大鼠的EPC歸巢明顯高于EPCs/vector組(P<0.05)。HE染色結果可見，與Blank組比較，EPCs/miR-199a agomir組和EPCs/vector組進入血栓的有核細胞明顯增多，血栓外周區見少量紅細胞，逐漸形成官腔樣結構，機化程度較高，而與EPCs/vector組比較，EPCs/miR-199a agomir機化程度更高。與Blank組比較，EPCs/miR-199a agomir組和EPCs/vector組重量顯著減輕，而miR-199a agomir組重量顯著小于EPCs/vector組(P<0.05)。見圖9、圖10、表3。

圖9 EPCs示蹤，熒光顯微鏡觀察各組熒光強度(×400)

圖10 HE染色觀察各組血栓機化(×400)

表3 miR-199a 調節內皮組細胞抑制DVT形成

3 討 論

DVT是臨床上常見的外周血管疾病，其發病率雖然不高，但由于經常繼發PTS而存在潛在死亡風險，據統計，30%～40% DVT患者在治療后1～2年內發生PTS，治療后5年內PTS的發生率則超過50%〔11，12〕。目前，臨床上用于治療DVT采用的方法主要為藥物抗凝或溶栓治療，但對于慢性期DVT治療效果不理想，因此，尋找一種更為有效的治療慢性期DVT的方法是當前研究的重點。血栓機化再通的關鍵在于使血栓內的血管新生，EPCs是一群具有游走性，能進一步增殖分化的幼稚內皮細胞，主要參與血管發生及血管損傷后修復等過程，研究發現外周血中的內皮祖細胞可歸巢到DVT促進血栓內血管新生、血栓溶解和再通〔13，14〕，應用內皮祖細胞治療DVT不失為一種具有廣闊應用前景的新方法。但外周血中EPCs含量很少，在VEGF等外源性細胞因子或血管損傷等內源性因素刺激下骨髓中EPCs動員至外周血循環中，而如何促進外周血中EPCs遷移及增強其歸巢至DVT中的能力是治療DVT的關鍵。miRNA是一類普遍存在于細胞中的長度為18～25 nt的非編碼小分子RNA，在基因轉錄后水平上與靶mRNA結合，降解或抑制mRNA的翻譯，發揮對多種蛋白的表達調控作用〔15〕。miR-199a家族廣泛存在于人體組織中，研究表明miR-199a在多種腫瘤組織中異常表達，除參與腫瘤細胞的生長增殖、凋亡、分化與轉移等生物學過程之外，還可調控腫瘤細胞的血管生成過程〔16，17〕。本研究發現，miR-199a在DVT大鼠EPCs中表達異常，采用過表達和抑制EPCs中miR-199a表達的研究策略發現miR-199a可促進內皮祖細胞的遷移、血管形成及歸巢至DVT中，有利于內皮祖細胞發揮功能抑制DVT。

經典Wnt信號通路可通過調節β-catenin-LEF1/TCFs轉錄復合物的形成而影響下游基因的表達變化，可參與細胞的增殖、分化及凋亡等進而調控許多疾病過程〔18〕。莫建文等〔19〕研究發現Wnt信號通路可參與調節血管內皮祖細胞功能，對Wnt信號傳導途徑進行干預，可能減輕血栓的嚴重程度甚至終止血栓的形成。Li等〔20〕研究發現經典Wnt信號通路受到多種分子和信號途徑的調節，其中TAK1-NLK非經典MAPK激酶途徑就是通過抑制β-catenin-LEF1/TCFs轉錄復合物來影響Wnt信號通路在細胞分化及發育等過程中的功能。然而，盡管TAK1能激活NLK分子的激酶活性，但二者之間并沒有直接的相互作用，表明二者之間的信號傳遞需要依賴其他分子的協助。該研究還發現TAK1的一個結合蛋白TAB2可直接并特異性的結合NLK，TAB2可作為一種“腳手架蛋白”連接TAK1和NLK形成復合物，從而引起二者之間的間接相互作用。TAB2通過這種方式促進TAK1對NLK的激活，導致NLK底物LEF1/TCFs分子的磷酸化而抑制其轉錄活性，進而對Wnt信號通路發揮抑制作用。本研究通過生信網站targetscan預測發現TAB2蛋白的3′UTR存在與miR-199a的結合位點。在轉染miR-199a抑制劑的EPCs中利用小干擾RNA技術敲減TAB2表達后，EPCs遷移和血管形成能力顯著增高，且過表達miR-199a后可有效促進DVT的機化再通，進一步證實了miR-199a通過靶向TAB2調節EPCs發揮生物學功能。