朱璉緩慢捻進法對衰老大鼠超氧化物歧化酶表達的影響

毛佳楠 羅偉 王莉靈 趙彩嬌

(廣西中醫藥大學針灸推拿學院，廣西 南寧 530001)

衰老的機制眾多，有自由基學說〔1,2〕、端粒學說〔3〕、細胞凋亡學說〔4,5〕等。其中，自由基學說是世界范圍內被認可的主流學說。超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶的重要組成部分之一，它協同過氧化氫酶清除自由基。有研究發現針刺對衰老模型大鼠具有顯著療效，其延緩衰老機制與調節自由基代謝有著密切的關系〔6～9〕。朱璉緩慢捻進法是在針尖輕觸皮膚后，進行捻轉，同時稍加向下的壓力，時而停時而捻，如此反復，將針捻入皮膚之后，繼續緩慢捻轉尋找針感，直到預定深度的一種進針法〔10〕。研究〔11～13〕表明普通針刺能夠改善衰老相關指標水平的表達。對比普通針刺和朱璉緩慢捻進法，其差異主要在于進針的過程，而朱璉緩慢捻進法在衰老相關領域的實驗研究較少，目前尚不清楚進針過程的差異對延緩衰老效果的影響。本研究以亞急性衰老模型大鼠為研究對象，探討朱璉緩慢捻進法延緩衰老的機制，從預防和治療兩方面觀察朱璉緩慢捻進法對衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝組織中 SOD mRNA相對表達量的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供的健康SD大鼠60只，雄性，體重240～280 g。動物合格證號：SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠飼養于溫度23～25℃的實驗室。實驗開始前先適應性喂養14 d，整個飼養過程中大鼠自由攝食和飲水。適應性飼養結束后將所有大鼠按隨機數字表法分成空白對照組、模型對照組、朱璉緩慢捻進法預防組、普通針刺預防組、朱璉緩慢捻進法治療組、普通針刺治療組，每組10只。飼養與實驗全程對動物的處置符合國家科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2主要儀器及試劑 華佗牌“承臻”一次性使用無菌針灸針(規格0.25 mm×25 mm,蘇州醫療用品廠有限公司)，BCD-216SDM冰箱(青島海爾股份有限公司)，MT70-2微孔板恒溫孵育器(杭州米歐儀器有限公司)，Epoch全波長酶標儀(美國Biotek公司)，CBFSTPRP-24全自動研磨器(上海測博生物科技發展中心)，QuantStudio 6實時熒光定量-聚合酶鏈的反應(PCR)儀(美國ABI公司)，HI650離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，玻璃毛細管(華西醫科大學儀器廠)，D-半乳糖(美國Sigma公司)，0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業股份有限公司)，SOD試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，15596-026總RNA抽提試劑(美國Ambion公司)，R101-01/02反轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，AI101核糖核酸酶抑制劑(北京全式金生物技術有限公司)。

1.3大鼠亞急性衰老模型的建立 參考崔美芝等〔14〕造模方法，用0.9%氯化鈉溶液將D-半乳糖配制成10%的D-半乳糖溶液，以腹腔注射的方式給藥(500 mg/kg)，現配現用。大鼠每日空腹稱體重，除空白對照組外，所有大鼠每天于9時腹腔注射D-半乳糖溶液。連續造模42 d出現豎毛拱背、毛色枯黃無光澤、畏寒肢冷、進食量減少、精神萎靡、行動遲緩等衰老征象，提示造模成功。

1.4治療方法 參照趙彩嬌等〔15〕治療時程安排，預防組每日造模給藥結束后進行治療，共42 d；治療組待整體實驗造模結束后再治療，共治療28 d。朱璉緩慢捻進法預防組：給藥完畢后將大鼠以仰臥位固定，進行預防治療。參照《大鼠穴位圖譜的研制》〔16〕，取“關元”、雙側“足三里”，采用朱璉緩慢捻進法，進針全程耗時2 min，留針30 min，中途用捻轉補法行針1次，約1 min，每日1次，共42 d。普通針刺預防組：給藥后，將大鼠以仰臥位固定，進行預防治療，取“關元”、雙側“足三里”，常規針刺留針30 min，中途用捻轉補法行針1次，約1 min，每日1次，腧穴定位、治療時間同朱璉緩慢捻進法預防組。朱璉緩慢捻進法治療組：造模成功次日開始進行治療，取穴、腧穴定位及操作方法同朱璉緩慢捻進法預防組，共治療28 d。普通針刺治療組：造模成功次日開始進行治療，取穴、腧穴定位及操作方法同普通針刺預防組，共治療28 d。

1.5觀察指標及方法 血清SOD活性的檢測：各組大鼠于造模后和治療結束后次日用玻璃毛細管進行眶底靜脈叢采血1.5 ml，4 ℃過夜后，3 000 r/min離心15 min，取上清液進行檢測。分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。于酶標包被板上的標準孔中加樣 50 μl，待測樣品孔中先后加入樣品稀釋液和待測樣品各40 μl和10 μl。封板后37℃溫育30 min，棄去液體，甩干后加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。除空白孔外，每孔加入酶標試劑50 μl。封板后37℃溫育30 min后棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干。每孔先后加入各50 μl顯色劑A、B輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液 50 μl，使反應終止。在添加終止液之后的15 min內，空白孔調零，波長450 nm，測量各孔的吸光度(OD值)。用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，計算出樣品濃度后再乘以稀釋倍數，即可得出樣品的實際濃度。

SOD mRNA的檢測：各組大鼠于治療結束次日稱重后用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,完成眶底靜脈叢采血后處死，于冰臺上快速取肝，剪碎100 mg肝組織立即浸泡RNA保存液，放入液氮貯存。使用實時熒光定量-PCR檢測SOD mRNA的相對表達量。取新鮮冰凍組織，加入總RNA抽提試劑1 ml，研磨成漿，移至無RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min。加入氯仿200 μl，混勻，室溫放置5 min。離心15 min(12 000 r/min，4℃)，可見分成上中下三相。轉移上層水相于另一新1.5 ml EP管中，加入異丙醇400 μl，混勻，室溫靜置10 min后，離心10 min(12 000 r/min，4℃)，于管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 ml，渦旋混勻后，離心5 min(10 000 r/min，4℃)。重復1次。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl 的DEPC水中。將RNA用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。cDNA做5倍稀釋后進行擴增。擴增反應體系組成：各0.4 μl的上游引物和下游引物(委托北京擎科生物科技有限公司合成)，SOD1正義鏈：5′-GAGAGCATTCCATCATTG-3′，反義鏈：5′-GAGACTCAGACCACATAG-3′；SOD2正義鏈：5′-GGAGATGTTACAACTCAG-3′，反義鏈：5′-CTCCTTAAACTTCTCAAAAG-3′；SOD3正義鏈：5′-CTAGGAATCCTTCACACC-3′，反義鏈：5′-GAGCAAACTCAAAGACTG-3′。0.4 μl的50×ROX Reference Dye 2、10 μl的SYBR Green Master Mix、4.8 μl的ddH2O。擴增反應條件：預變性(95℃，10 min)；變性(95℃，30 s)，退火/延伸(60℃，30 s)，40個循環，最終延伸(50℃，2 min)。于熒光定量PCR儀上進行擴增反應，每個循環由電腦自動記錄反應管中的熒光信號值，并描繪曲線。采用雙標準曲線法對數據進行相對定量分析。按照2-△△ct相對定量計算公式，計算出各樣品的目的基因相對定量結果。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1朱璉緩慢捻進法和普通針刺對衰老模型大鼠血清中SOD活性的影響 造模結束后，與空白對照組相比，模型對照組血清中SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型對照組相比，兩個預防組血清SOD活性顯著上升(P<0.05)；兩個治療組血清中SOD活性相對模型組，差異無統計學意義(P>0.05)；預防組中使用朱璉緩慢捻進法的SOD活性更高(P<0.05)。治療結束后，模型對照組血清SOD活性顯著低于空白對照組(P<0.05)。預防組和治療組血清中SOD活性較模型對照組均顯著上升(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進法預防組相比，普通針刺預防組的活性更低(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進法治療組相比，普通針刺治療組的活性更低(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進法治療組相比，朱璉緩慢捻進法預防組活性更高(P<0.05)，和普通針刺治療組相比，普通針刺預防組的活性更高(P<0.05)。見表1。

2.2朱璉緩慢捻進法和普通針刺對衰老模型大鼠肝組織中SOD基因表達的影響 實驗結束后，模型對照組肝組織中SOD mRNA的相對表達量顯著低于空白對照組(P<0.05)；預防組和治療組的肝組織SOD mRNA的相對表達量顯著高于模型對照組(P<0.05)；預防組和治療組中，采用朱璉緩慢捻進法肝臟SOD mRNA相對表達量顯著高于采用普通針刺法(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進法治療組相比，朱璉緩慢捻進法預防組SOD mRNA相對表達量更高(P<0.05)；和普通針刺治療組相比，普通針刺預防組的SOD mRNA相對表達量更高(P<0.05)。見表1。

表1 造模后、治療后各組血清SOD活性及治療后肝組織SOD mRNA表達比較

3 討 論

本研究結果說明，朱璉緩慢捻進法和普通針刺均可起到良好的防止血清SOD活性降低的作用；朱璉緩慢捻進法預防血清SOD活性降低的效果較普通針刺更明顯；朱璉緩慢捻進法比普通針刺提高SOD活性的效果持久；朱璉緩慢捻進法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD的活性；朱璉緩慢捻進法提高SOD活性的效果優于普通針刺；使用朱璉緩慢捻進法對衰老進行預防性干預的效果優于治療性干預；使用普通針刺對衰老進行預防性干預的效果優于治療性干預，朱璉緩慢捻進法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD基因的表達；朱璉緩慢捻進法提高SOD mRNA相對表達量的效果優于普通針刺；使用朱璉緩慢捻進法對衰老進行預防性干預的效果優于治療性干預；使用普通針刺對衰老進行預防性干預的效果優于治療性干預。

自由基能與核酸反應，降解堿基，破壞氫鍵，使基因發生突變；自由基除了能氧化蛋白質，使多肽鏈斷裂，還能抑制蛋白質合成；自由基還極易與胞膜內的不飽和脂肪酸反應，生成脂質自由基，對細胞的各種膜結構產生巨大的破壞〔2〕。以上種種共同導致了細胞組織的老化，從而產生了衰老。雖然機體的正常代謝能有效清除自由基，但抗氧化劑和自由基清除劑隨著年齡的增長而減少，導致自由基水平升高，細胞和組織的結構功能受到不可逆的損傷，從而引起衰老。

SOD是一類廣泛存在于動植物體內的抗氧化酶，能夠催化代謝產生的超氧陰離子自由基發生歧化反應，生成過氧化氫和氧，過氧化氫則可在過氧化氫酶的作用下被分解成水和氧，從而清除體內的自由基，維持動態平衡。在動物體內，SOD主要分為存在于胞質和胞核中的Cu/Zn SOD(SOD1)、存在于線粒體中的Mn SOD(SOD2)和存在于細胞外的EcSOD(SOD3)。SOD從牛紅細胞中分離提純獲得〔17〕，研究發現了SOD催化超氧陰離子發生歧化反應的特性〔18〕。研究表明SOD具有通過清除自由基來延緩衰老的作用〔19〕，亦有研究表明針刺能夠通過改善SOD的表達，來延緩衰老〔20～24〕。本研究發現，朱璉緩慢捻進法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD活性和SOD基因表達，是對以往研究的印證。

朱璉緩慢捻進法是我國著名針灸學家朱璉先生提出的一種進針法。朱璉認為針灸治病的關鍵在于激發和調整機體內部神經系統的調節功能和管制功能〔25〕。根據調整神經系統的原理及現代神經生理學說的認識，發現針灸對機體進行刺激，產生的皮膚感覺，可能投射回大腦皮層上相對應的點，從而達到治療目的〔25〕。朱璉緩慢捻進針法的基本操作步驟如下：①施針者在針尖尚未接觸皮膚時要捏緊針柄，以防無菌的針掉落；②刺手靠近預定腧穴后使針尖輕輕接觸皮膚，此時刺手手指稍微放松，進行緩慢地捻轉，在停止捻轉時捏緊針柄；③如此捻捻停停，停停捻捻，在捻轉的同時稍稍施加壓力，將針捻入；④捻入皮膚后繼續捻轉以尋找針感，直到預定的深度。施針者在操作全程中要保持注意力集中，刺手穩定，以防止偏離穴位或用力不當。朱璉將上述步驟總結成4句口訣：“指實心清緊執針，針尖刺穴近穩輕；肘平腕舉手抬起，虛實交替捻入深”〔10〕。

祖國醫學認為臟腑虛衰、陰陽失調、氣血虛損等是造成衰老的幾大原因。體表皮膚分布著大量的感覺神經末梢，作用于皮膚的刺激通過感受器轉換成傳入神經上的動作電位〔25〕，經脊神經反射性地調整大腦皮質功能，從而改善機體狀態與功能。朱璉緩慢捻進法通過上述的操作，皮膚的末梢神經獲得持續性刺激，產生皮膚感覺，通過淺感覺傳導通路〔26〕投射至大腦皮層，維持并改變大腦皮層的興奮狀態〔25〕，并通過控制神經遞質和自主神經〔25〕，從而激活、調動神經功能，使全身的經脈和臟腑都能接受到神經信號的刺激，各臟腑、經脈的功能慢慢恢復，繼而氣血充盛、陰陽調和，從而達到延緩衰老的作用。

此外，本研究選用了常規的保健穴“關元”和“足三里”。兩穴一陰一陽，相輔相成，起到了補益氣血，益腎固元，調整陰陽的作用。“關元”和“足三里”合用，能夠抗自由基氧化，延緩衰老已在多項研究中被證實〔6，8，21,27～30〕。

綜上，朱璉緩慢捻進法可以有效調整亞急性衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝組織中 SOD mRNA相對表達量，對衰老模型大鼠具有顯著的防治作用，提示朱璉緩慢捻進法延緩衰老的機制可能與調節SOD代謝相關；使用朱璉緩慢捻進法和普通針刺對衰老進行預防性干預的效果優于治療性干預；朱璉緩慢捻進法對衰老模型大鼠的防治作用優于普通針刺。