miR-520f-3p靶向MCL1抑制結腸癌細胞生長及移植瘤發生

陶正貴 杜靜虎 田葵 王東華 胡鳳琪 陳滿宇

(湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院 1普外科，湖北 襄陽 441000；2腎內科)

在世界范圍內，結腸癌是全世界癌癥死亡的第二大主要原因〔1〕。結腸癌特征是結腸部分細胞的異常凋亡和惡性生長，結腸癌的常用治療方法是手術、化學療法、放射療法和靶向療法〔2〕。由于人們生活水平的提高、飲食的變化、多脂食品和多糖食品等食品的消費增加、生活節奏加快、工作壓力增加和環境污染，結腸癌的發病率逐年增加〔3〕。盡管在結腸癌的治療方面取得了顯著進展，結腸癌的5年生存率已超過60%，但在治療過程中仍然存在很多問題〔4〕。鑒于此，迫切需要更有效和新穎的結腸癌治療藥物和策略。miRNA參與了許多細胞過程的調節，包括代謝穩態、細胞增殖和細胞凋亡〔5〕。miRNA的異常表達已經與多種人類疾病的發病機制緊密相關，幾乎所有類型的癌癥都存在。miRNA在癌癥發展中的作用相當復雜，miRNA既可以通過抑制腫瘤抑制基因充當癌基因，也可通過負調控癌基因mRNA發揮腫瘤抑制作用〔6〕，其中miR-520f-3p是有效的mRNA之一。已有研究表明，miR-520f-3p靶向性別決定區Y框蛋白(SOX)9抑制胃癌細胞增殖〔7〕；也有研究表明miR-520f-3p通過負調控高氨酸拉鏈下調因子(LDOC)1增加膠質瘤的干性〔8〕。但miR-520f-3p在結腸癌中的作用尚不清楚。本文主要研究miR-520f-3p對結腸癌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 miR-NC、pc-NC、miR-520f-3p mimic、miR-520f-3p inhibitor、pc-髓樣細胞白血病蛋白(MCL)1質粒和實驗所用各種引物由北京奧科生物科技有限公司設計并合成，Lipofectamine2000轉染試劑(上海少辛生物科技有限公司，貨號：11668-019)，胎牛血清(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：QS071)，RPMI1640培養基(北京清大天一科技有限公司，貨號：MD800)，青霉素和鏈霉素雙抗溶液(北京沃比森科技有限公司，貨號：C0160-611)，SYBR-Green聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(嘉興藍諾盛生物科技有限公司，貨號：RT0411-03)，RIPA裂解緩沖液(上海雅酶生物科技有限公司，貨號：PC101)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京威格斯生物技術有限公司，貨號：T002)，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(西安浩特生物科技有限公司，貨號：WB027)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、Ki67、增殖細胞核抗原(PCNA)、cleaved caspase-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、MCL1抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號：ab36151、ab92742、ab18197、ab2302、ab32503、ab182858、ab32087)，裸鼠購自四川夏派森醫藥科技有限公司，許可證：SYXK(川)2017-203。FluorChem HD2凝膠成像系統購自美國Proteinsimple公司，BS-1101全自動多功能酶標儀購自北京華泰和合商貿有限公司，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司，Seahorse XF24分析儀購自美國Seahorse公司。

1.2細胞及培養 正常結腸上皮細胞HCoEpiC和結腸癌細胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)均購自上海素冉生物科技有限公司。在37℃、5% CO2條件下，所有細胞于含體積分數為10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素和鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640培養基中培養。

1.3組織樣品 在2018年2月至2020年2月期間，從湖北文理學院附屬醫院行腫瘤瘤切除術的患者中獲取組織。該研究得到醫院研究倫理委員會批準，并根據《赫爾辛基宣言》的道德準則進行，且獲得患者同意并簽訂知情同意書。

1.4實時熒光定量(RT-q)PCR檢測miR-520f-3p mRNA表達 將正常結腸組織和結腸癌組織剪碎并研磨，然后裂解提取總RNA。對于細胞，將正常結腸上皮細胞HCoEpiC和結腸癌細胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)接種在12孔板中，當細胞達到近85%融合時，用RIPA裂解提取總RNA。用 cDNA逆轉錄試劑盒逆轉錄，以cDNA為模板按SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進行RT-qPCR。miR-520f-3p的循環條件為：95℃ 15 s和61℃ 35 s的40個循環，用U6標準化。使用2-ΔΔCt方法計算。每個樣品進行3次重復分析。引物序列為：miR-520f-3p正義鏈：5′- ACACTCCAGCTGGGCCTCTAAAGGGAAGCG-3′，反義鏈：5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAG-3′；U6正義鏈：5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5細胞轉染 取對數期結腸癌HT-29細胞，以每孔1×106密度接種于12孔板。當達到85% 融合，根據Lipofectamine2000說明書按照分組將miR-NC、miR-520f-3p mimic、miR-520f-3p inhibitor和pc-NC、pc-MCL1質粒分別或聯合轉染進入HT-29細胞。

1.6克隆形成實驗檢測細胞生長能力 將1.5轉染的結腸癌HT-29細胞接種于6孔板，每孔1×106，直到生長至可見克隆細胞。用甲醇固定可見克隆細胞，0.25% 結晶紫染色30 min，計數克隆細胞數量。

1.7流式檢測細胞凋亡率 取1.5轉染的結腸癌HT-29細胞培養24 h后，離心收集細胞，并按1×106個細胞/ml的濃度重懸。細胞懸液中加入5 μl FITC標記的膜聯蛋白V和碘化啶，避光孵育15 min，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.8裸鼠移植瘤實驗 所有裸鼠分為4組：Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、miR-520f-3p inhibitor組。在每只裸鼠左腋下皮下注射100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中5×106各轉染的結腸癌HT-29細胞，繼續在SPF條件下正常飲食飼養〔9〕。第30天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，測定移植瘤體積和重量，TUNEL檢測細胞凋亡率，Western印跡檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平。其中移植瘤體積測量方法是用游標卡尺分別測出a：長徑；b：寬徑；c：高，再用公式：V=πabc/6進行計算。

1.9Western印跡檢測Ki67、PCNA、 cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和MCL1蛋白表達水平 收集1.5轉染的結腸癌HT-29細胞和1.8移植瘤組織。用RIPA裂解液裂解細胞和組織并提取總蛋白。然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，再用半干轉膜儀轉移到聚偏氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。接著加入對應的兔來源的單克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶800、Bcl-2 1∶1 000、MCL1 1∶1 000)，于4℃ 封閉過夜。然后，加入對應辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆二抗(1∶2 000)室溫封閉1 h，最后滴電化學反應液曝光。以GAPDH為內參，使用軟件ImagePro Plus6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白相對表達水平=目標蛋白積分吸光度值/內參蛋白GAPDH積分吸光度值。

1.10TUNEL染色檢測移植瘤細胞凋亡 取移植瘤組織固定后，常規石蠟切片，玻片預先用多聚賴氨酸處理以防止脫片。切片脫蠟入水后按TUNEL染色試劑盒內使用說明操作，二氨基聯苯胺(DAB)染色，常規脫水、透明、封片，光鏡下檢查。棕褐色細胞代表凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.11免疫組化檢測Ki67陽性表達水平 石蠟切片經脫蠟水化，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性，加入兔來源Ki67單克隆抗體(1∶250)，4℃過夜，滴加生物素標記二抗，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察統計。著色為棕黃色的表示細胞陽性。隨機選取5個視野用Image J計數陽性著色細胞，計算陽性細胞百分率(%)。

1.12雙熒光素酶報告檢測靶向關系 收集生長至對數期的結腸癌HT-29細胞，接種于24孔板中，并在37℃、5%CO2條件的培養箱培養24 h。然后，將1 μg PGL3-MCL1-WT(MCL1野生型)或PGL3- MCL1-MUT(MCL1突變型)及miR-NC或miR-520f-3p mimic和PRL-CMV質粒共轉染入結腸癌HT-29細胞，轉染48 h后，結腸癌HT-29細胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統測量熒光素酶的相對活性，熒光素酶的相對活性(R/F)=螢火蟲熒光素酶活性/腎熒光素酶活性。

1.13統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1miR-520f-3p在結腸癌組織和細胞中的表達情況 與正常結腸組織(0.45±0.07)相比，結腸癌組織中miR-520f-3p 的mRNA表達(0.45±0.07)顯著下調(P<0.01)；與人正常結腸上皮細胞HCoEpiC(1.00±0.08)相比，結腸癌細胞系(HT-29、SW480、LOVO、HCT15、Colo205、SW620)中miR-520f-3p 的mRNA表達(0.34±0.07、0.42±0.08、0.51±0.09、0.38±0.06、0.47±0.08、0.44±0.09)顯著下調(均P<0.01)，選取HT-29細胞做后續實驗。

2.2miR-520f-3p對HT-29細胞增殖和凋亡的影響 與Control相比，miR-NC組HT-29細胞克隆細胞數目、細胞凋亡率均無明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組HT-29細胞克隆細胞數目顯著減少，細胞凋亡率顯著增加(P<0.01，見表1，圖1)；miR-520f-3p inhibitor組HT-29細胞克隆細胞數目顯著增加，細胞凋亡率顯著減少(P<0.01，表1，圖2)。進一步運用Western印跡檢測HT-29細胞中增殖和凋亡相關蛋白的表達。與Control組相比，miR-NC組HT-29細胞中Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達均無明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組HT-29細胞中Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著下調，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平顯著上調(均P<0.01)，miR-520f-3p inhibitor組HT-29細胞中Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著上調，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平顯著下調(均P<0.01，見表2，圖3)。

表1 miR-520f-3p對結腸癌HT-29細胞克隆形成和凋亡率的影響

圖1 克隆形成實驗檢測細胞增殖(結晶紫染色，×100)

圖2 流式檢測各組細胞凋亡率

表2 各組HT-29細胞中增殖與凋亡相關蛋白的影響

1～4：Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、miR-520f-3p inhibitor組圖3 Western印跡檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

2.3miR-520f-3p對結腸癌HT-29移植瘤生長的影響 與Control組相比，miR-NC組結腸癌HT-29移植瘤體積和重量、細胞凋亡率、Ki67陽性細胞百分率均無明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組結腸癌HT-29移植瘤重量和體積顯著減少，細胞凋亡率顯著增加，Ki67陽性細胞百分率顯著降低(均P<0.01)；miR-520f-3p inhibitor組結腸癌HT-29移植瘤重量和體積及Ki67陽性細胞百分率顯著增加，細胞凋亡率顯著減少(均P<0.01)。見圖4，表3，圖5，圖6。進一步運用Western印跡檢測了腫瘤組織中增殖和凋亡相關蛋白的表達。與Contro組相比，miR-NC組結腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表達均無明顯變化(P>0.05)；miR-520f-3p mimic組結腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著下調，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平顯著上調(均P<0.01)；miR-520f-3p inhibitor組結腸癌HT-29移植瘤組織中Ki67和PCNA蛋白表達水平顯著上調，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達水平顯著下調(均P<0.01)。見表4，圖7。

2.4miR-520f-3p和MCL1靶向關系 通過 Targetscan軟件預測發現，miR-520f-3p與MCL1具有靶向關系，在3′UTR區存在結合位點；通過雙熒光素酶發現，與miR-NC組(1.00±0.07)相比，miR-520f-3p mimic與PGL3-MCL1-WT共轉染使熒光素酶活性(0.41±0.08)顯著降低(P<0.01)。與Control組(0.58±0.05)相比，miR-NC組(0.56±0.06)和pc-NC組HT-29細胞中MCL1表達(0.57±0.06)無明顯變化(P>0.05)，miR-520f-3p mimic組HT-29細胞中MCL1表達(0.01±0.07)顯著下調，pc-MCL-1組HT-29細胞中MCL1表達(0.86±0.08)顯著上調(P<0.01)。見圖8。

圖4 各組移植瘤

表3 miR-520f-3p對HT-29移植瘤生長的影響

圖5 TUNEL染色檢測各組移植瘤細胞凋亡(×200)

圖6 免疫組化檢測各組Ki67表達水平(×200)

表4 miR-520f-3p對腫瘤組織中增殖與凋亡相關蛋白的影響

圖7 蛋白印跡法檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平

A：Targetscan軟件預測miR-520f-3p與MCL1靶向關系；B：Western印跡法檢測MCL1蛋白表達水平;1～5:Control組、miR-NC組、miR-520f-3p mimic組、pc-NC組、pc-MCL1組圖8 miR-520f-3p和MCL1靶向關系

2.5MCL1過表達對miR-520f-3p在HT-29細胞增殖和凋亡的影響 與miR-520f-3p mimic+pc-NC相比〔(44.15±7.14)個、(28.53±5.78)%〕，miR-520f-3p mimic+pc-MCL1組HT-29細胞克隆細胞數目〔(98.27±10.52)個〕顯著增加，細胞凋亡率〔(9.43±3.45)%〕顯著減少(P<0.01)。與miR-520f-3p mimic+pc-NC相比，miR-520f-3p mimic+ pc-MCL1組HT-29細胞中Ki67和PCNA蛋白表達顯著上調，cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達顯著下調(P<0.01)，見圖9、表5。

A：克隆形成實驗檢測細胞增殖(結晶紫染色，×100)；B：流式檢測細胞凋亡率；C：Western印跡法檢測Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平；1～2：miR-520f-3p mimic+pc-NC組、miR-520f-3p mimic+pc-MCL1組圖9 MCL1過表達對miR-520f-3p在HT-29細胞增殖和凋亡的影響

表5 MCL1過表達對miR-520f-3p在腫瘤組織中增殖與凋亡相關蛋白的影響

3 討 論

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，隨著人們生活水平的提高，結腸癌的發病率也緩慢上升〔10〕。由于miRNA在體液中穩定，無論是在分泌的微泡中還是與載體蛋白結合，miRNA都可以作為早期癌癥診斷的生物標志物。已有研究提出，miR-520f可作為肺癌診斷的生物標志物〔11〕。同一RNA在不同種類的腫瘤細胞中也具有不同的作用，如在人類黑色素瘤細胞中，miR-520f通過調控Itch表達促進細胞增殖，從而發揮致癌作用〔12〕；在肝癌中，miR-520f靶向TM4SF1抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，從而發揮抑癌作用〔13〕。結腸癌特征是結腸部分細胞的異常和惡性生長。本研究表明，miR-520f-3p 過表達抑制結腸癌HT-29細胞增殖及移植瘤的生長，并誘導細胞凋亡，下調Ki67和PCNA蛋白表達，上調cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達；miR-520f-3p 低表達促進結腸癌HT-29細胞增殖及抑制瘤的生長，并抑制細胞凋亡，上調Ki67和PCNA蛋白表達，下調cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達。Ki67和PCNA蛋白是增殖標記蛋白，其表達量與細胞的增殖情況呈正比；cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2是凋亡標記蛋白，其cleaved caspase-3表達量及Bax/Bcl-2表達量比值均與細胞的凋亡情況呈正比〔14〕。因此，miR-520f-3p在結腸癌中作為抑癌基因，抑制結腸癌細胞生長及移植瘤發展。這與miR-520f通過靶向ATP酶家族AAA含域蛋白2抑制胃癌細胞的生長結果相類似〔15〕。

miRNAs通過與靶mRNA的3′-UTR結合來調控基因表達。為了更好地了解其機制，本研究通過基因預測軟件預測發現，miR-520f-3p與MCL1具有靶向關系，在3′-UTR區存在結合位點。并通過熒光素酶實驗驗證了miR-520f-3p與MCL1具有直接靶向關系。MCL1位于染色體lq21，是一種屬于Bcl-2家族的抗凋亡基因，通常在許多惡性腫瘤中表達上調，發揮致癌作用〔16〕。已有研究表明，MCL1在結腸癌中高表達，MCL1降解是靶向治療結腸癌所必需的〔17〕。已有研究表明，在膠質瘤中，沉默MCL1基因可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路促進腫瘤細胞的衰老和凋亡〔18〕；在胃癌，中miR-125b通過靶向MCL1抑制腫瘤細胞增殖和侵襲〔19〕；在骨髓瘤中，miR-126通過下調抗凋亡蛋白MCL1誘導細胞凋亡〔20〕；在喉癌細胞中，miR-363的上調導致MCL1表達下降，可使細胞的增殖和侵襲減弱，加速細胞凋亡〔21〕。因此，通過抑制MCL1的表達抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞的凋亡是癌癥預防的一種手段。本研究這說明miR-520f-3p通過靶向下調MCL1，來抑制結腸癌細胞生長及移植瘤的發展。這與MCL-1異常高表達與Bax和caspase-3的低表達共同抑制肝癌細胞的凋亡，并且三者在原發性肝癌的發生和發展過程中發揮作用〔22〕。

綜上，miR-520f-3p靶向MCL1抑制結腸癌細胞增殖及移植瘤的發展，說明miR-520f-3p 和MCL1可作為潛在的分子治療靶點。但本文僅為作用機制的初步探討，具體的分子通路機制還有待研究。