RNA 干擾β-catenin 基因?qū)Υ竽c癌細胞SW480的生長抑制及基因表達

李鑫鑫 李安慶 趙衛(wèi)東 紀(jì)紅梅 王峰

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬臨淄區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 淄博 255400)

RNA干擾(RNAi)是小片段雙鏈RNA分子(siRNA)介導(dǎo)的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。是研究基因功能的一種重要技術(shù)，目前已廣泛用于基因組的研究及腫瘤的治療研究。研究認為，Wnt/β-catenin 信號通路在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。90%以上的大腸癌存在 Wnt/β-catenin 信號通路的激活以及β-catenin 在細胞內(nèi)的積聚。調(diào)節(jié)β-catenin 在胞內(nèi)的穩(wěn)定及積累是Wnt 信號通路中最關(guān)鍵的事件之一。本試驗通過 RNA干擾技術(shù)，誘導(dǎo)β-catenin 基因沉默，探討 RNA干擾技術(shù)對大腸癌治療的價值。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗細胞 大腸腺癌細胞株 SW480由四川大學(xué)華西醫(yī)院消化外科與器官微循環(huán)試驗室提供。

1.1.2主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、新鮮胎牛血清(Gibco公司)；siRNA雙鏈體 (上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI，Sigma公司)；引物合成及探針修飾(上海生工生物工程公司)；Taq DNA聚合酶、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)緩沖液(10X)、MarkerDL2000 (TaKaRa公司)；瓊脂糖 (Bio west公司)。

1.1.3主要儀器 Class II A/B3超凈工作臺、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；高速離心機(德國Heraeus公司)；實時熒光定量基因擴增儀 iCycler iQ、Model 550酶免疫檢測儀(美國Bio-Rad)。

1.2試驗方法 siRNA的設(shè)計與合成根據(jù) siRNA 設(shè)計原則設(shè)計并合成β-catenin基因編碼區(qū)的3個siRNA序列，如下:siRNA片段1正義鏈5′-GGAUGUGGAUACCUCCCAATT-3′，反義鏈5′-UUGGGAGGUAUCCACAUCCTT-3′;siRNA片段2正義鏈5′-CCCACUAAUGUCCAGCGUUTT-3′，反義鏈5′-AAC-GCUGGACAUUAGUGGGTT-3′；siRNA片段3正義鏈5′-GCUGGUGGAAUGCAAGCUUTT-3′，反義鏈5′-A-AGCUUGCAUUCCACCAGCTT-3′；無意義鏈正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-AC-GUGACACGUUCGGAGAATT-3′。siRNA 模板合成后，根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作。

1.2.1細胞復(fù)蘇及傳代 SW480細胞株解凍后，加入預(yù)熱的RPMI1640 培養(yǎng)基，離心，移去上清液，再加入新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、20 mmol/L碳酸氫鈉、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞融合生長至80%培養(yǎng)瓶底面時，用0.25%胰蛋白酶溶液制成懸液，混合均勻后，按1∶2～1∶3比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，每2～3 d傳代1次，試驗所用細胞處于對數(shù)生長期。

1.2.2siRNA 雙鏈體轉(zhuǎn)染 siRNA 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化回收細胞，以1∶10的比例用不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細胞，向六孔板的每孔中加入2 ml的細胞懸液，每孔中大約有3×105個細胞。細胞接種24 h后進行轉(zhuǎn)染，確保轉(zhuǎn)染時細胞密度為50%～80%。在一個EP管(A管)中加入4 μl 20 μmol/L的siRNA雙鏈體和296 μl的RPMI1640培養(yǎng)基混勻，在另一個EP管(B管)中，向292 μl的RPMI1640培養(yǎng)基中加入8 μl脂質(zhì)體Lipofectamine2000,將A管溶液緩慢加入B管溶液中，輕混，于室溫孵育20～25 min形成脂質(zhì)體復(fù)合物。將脂質(zhì)體復(fù)合物按每孔600 μl加入SW480細胞中，并設(shè)陰性對照和空白對照。通過輕輕敲擊培養(yǎng)板30 s以使之混勻，將細胞培養(yǎng)板于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后觀察不同時間點的作用。

1.2.3RT-PCR

1.2.3.1引物和探針設(shè)計 β-catenin 正義鏈5′-CCTGCCATCTGTGCTCTTC-3′，反義鏈5′-GACAAA-GGGCAAGATTTCGA-3′，β-catenin探針5′-FAM-TGACCAGCCGACACCAAGAAGCA-ECLIPSE-3′β-actin正義鏈5′-AAGGCCAACCGCGAGAA-3′，反義鏈5′-CCTCGTAGATGGGCACA-3′，β-actin探針5′-FA-MTCAACACCCCAGCCATGTACGTTAMRA-3′。用FAM熒光作報告基團標(biāo)記探針5′端，用 TAMRA 熒光淬滅基團標(biāo)記 3′端。

1.2.3.2RT-PCR檢測細胞β-catenin mRNA表達 取6孔板5個，每孔接種3×105個細胞培養(yǎng)，每孔加入2 ml培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)24 h貼壁后轉(zhuǎn)染，分組為 siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組、陰性對照組、空白對照組,每組設(shè)置復(fù)孔6個。其中siRNA組轉(zhuǎn)染細胞時加入合成的β-catenin siRNA , 陰性對照組轉(zhuǎn)染細胞時加入合成的陰性對照 siRNA。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Trizol reagent 提取細胞總 RNA，參照說明書逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增，參照 GENE BANK 序列設(shè)計引物。設(shè) GAPDH 為內(nèi)參，并設(shè)相應(yīng)的陰性對照和空白對照，PCR條件：94℃ 2 min 1個循環(huán)，94℃ 20 s，54℃ 20 s，70℃ 30 s 80℃ 20 s，共 40 個循環(huán)。增益率為 1.5。PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4MTT比色法 以5×103個/孔的細胞濃度接種細胞于96孔板，每孔加入200 μl培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于37℃CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染，實驗終止前4 h加 MTT 20 μl/孔，繼續(xù) 37℃孵育，最后吸去孔內(nèi)液體，加入 DMSO 150 μl/孔，震蕩10 min。選擇 490 nm 波長，測定各孔光吸收值。計算每組細胞增殖抑制率，并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。增殖抑制率=(1-siRNA組光吸收值/對照組光吸收值)×100%

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡 細胞的接種與收集：取6孔板5個，每孔接種3×105個/ml細胞培養(yǎng)，每孔加2 ml培養(yǎng)基，貼壁24 h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后用胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，約1×106個/ml,細胞懸液離心，棄上清液，加1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)到離心管中，用1 ml槍頭吹打均勻后移入1 ml EP管，再次離心后棄上清液，加1 ml -20℃預(yù)冷的冰乙醇(70%乙醇)到小EP管中，蝸旋振蕩器上震蕩細胞至分散，置于4℃冰箱冷藏過夜。離心后將等體積的細胞懸液和PI染液混合，4℃放置20～30 min，測定前將樣品用300目尼龍膜過濾，將樣品加入FCM樣品室，以激發(fā)波長488 nm測定。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測 siRNA1、siRNA2、siRNA3組β-catenin mRNA表達均明顯低于陰性對照組及空白對照組(P<0.01)。siRNA1組、siRNA3組β-catenin mRNA表達明顯低于siRNA2組(P<0.01)，說明siRNA1組、siRNA3組干擾抑制作用優(yōu)于siRNA2組，前兩組對靶基因的干擾特異性優(yōu)于后者。siRNA1組和siRNA3組β-catenin mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。陰性對照組(無意義鏈)和空白對照組β-catenin mRNA表達無顯著差異(P>0.05)，證明非特異鏈不產(chǎn)生干擾效果。 見表1。

2.2流式細胞儀檢測SW480細胞的凋亡率 siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，siRNA1、siRNA2、siRNA3組細胞凋亡率明顯高于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)。siRNA1組、siRNA3組細胞凋亡率明顯高于siRNA2組(P<0.05)。說明siRNA組、siRNA3組干擾抑制作用比siRNA2組更強，siRNA1組、siRNA3組對靶基因的特異性優(yōu)于siRNA2組。而陰性對照組和空白對照組的凋亡率無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3MMT比色法 siRNA1、siRNA2、siRNA3組增殖抑制率明顯高于陰性對照組及空白對照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后48 h及72 h siRNA1組、siRNA3組增殖抑制率明顯高于siRNA2組(P<0.05)。說明siRNA1組、siRNA3組對靶基因的干擾特異性優(yōu)于siRNA2組。siRNA1組和siRNA3組增殖抑制率無顯著差異(P>0.05)。陰性對照組和空白對照組增殖抑制率無顯著差異(P>0.05)。各siRNA組增殖抑制率均有時間依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖抑制率比較

3 討 論

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于消化道腫瘤的第 3 位。具有惡性程度高、浸潤性生長、易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及易復(fù)發(fā)等生物學(xué)特點〔1，2〕。盡管診療技術(shù)的提高使結(jié)腸癌患者的預(yù)后有所改善，但晚期結(jié)腸癌患者的 5 年生存率仍然較低〔3〕。研究顯示多種人類腫瘤細胞中存在miRNA的異常表達，表明miRNA 的異常表達參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔4～8〕。不同的 miRNA 通過發(fā)揮癌基因和抑癌基因的作用參與細胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路廣泛參與生物體內(nèi)細胞信息調(diào)控，在細胞增殖、組織修復(fù)及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔11〕。β-catenin作為多種miRNA的調(diào)控靶基因，能夠通過進一步調(diào)控下游靶基因，對一系列生物學(xué)事件(如細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等)進行干預(yù)，最終影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔12〕。研究表明，β-catenin在諸如肝癌〔11〕、胃癌〔13，14〕、結(jié)腸癌〔15〕中高表達，證實，Wnt/β-catenin信號通路在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔15〕。Wnt通路被激活時，β-catenin進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄基因結(jié)合，啟動靶基因的表達，激活靶基因的致癌作用〔16〕。RNA干擾技術(shù)已成為一個很好的反向遺傳學(xué)研究工具，被廣泛用于基因功能的研究〔17～19〕和基因治療方式的研發(fā)〔20，21〕。其原理是雙鏈RNA(dsRNA)在細胞質(zhì)內(nèi)被一種稱為Dicer的酶特異識別并剪切成長度為20～23 bp的siRNA；然后siRNA被組裝到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)中。RISC被激活后，siRNA雙鏈被解鏈成正義鏈與反義鏈，反之siRNA鏈按照堿基互補的原則與靶標(biāo)mRNA完全互補結(jié)合，引導(dǎo)RISC對mRNA進行切割。mRNA被切割后降解，基因表達因此受到抑制〔17～19〕。

本研究證實靶向β-catenin 的 RNAi 可以有效誘導(dǎo)β-catenin 基因沉默， 有效抑制β-catenin蛋白的表達；針對β-catenin 的靶向 siRNA 可有效抑制大腸腺癌 SW480 細胞增殖，說明針對β-catenin 的 RNA 干擾對結(jié)腸癌 SW480 細胞的生長具有抑制作用。本研究結(jié)果考慮作用機制如下： 經(jīng)典 Wnt/β-catenin 信號通路的 Wnt配體與 卷 曲 蛋 白(FZD)受體及共同受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6 結(jié)合，啟動 Wnt 信號通路，DVL蛋白磷酸化后，將信號傳導(dǎo)入細胞內(nèi)，抑制多發(fā)性腺瘤病大腸桿菌(APC)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、軸蛋白(AXIN)、β-catenin復(fù)合體酶活性，進而β-catenin蛋白不被磷酸化，防止泛素蛋白酶對其識別降解。在 Wnt 信號缺失情況下，β-catenin能被磷酸化后的多蛋白復(fù)合體降解。該多蛋白復(fù)合體失活情況下，β-catenin將在細胞質(zhì)內(nèi)大量蓄積，達到一定濃度時進入細胞核內(nèi)與T細胞因子(TCF)結(jié)合，激活 TCF 轉(zhuǎn)錄，進而導(dǎo)致下游靶基因進一步轉(zhuǎn)錄〔22〕。RNAi技術(shù)可通過誘導(dǎo)β-catenin基因沉默并阻止β-catenin激活Wnt信號通路，從而抑制結(jié)腸腫瘤的生長。 β-catenin 的表達與大腸癌生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)〔16〕。阻斷β-catenin 表達可達到抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的目的〔16〕。如何有效抑制β-catenin 的表達是腫瘤治療的關(guān)鍵所在。RNA 干擾為腫瘤的分子生物治療開辟了新的途徑，提供了新思路。