miR-144-3p通過(guò)調(diào)控ABCG2信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移作用的影響

陶濤 任承德 陳國(guó)俊 強(qiáng)紫陽(yáng) 楊艷燕

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，青海 西寧 810001)

膀胱癌在我國(guó)的臨床發(fā)病率為泌尿系統(tǒng)腫瘤首位，且術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)60%以上。常用臨床治療方法有外科手術(shù)、化療及放療，膀胱癌的初期這些治療方法結(jié)合治療取得相對(duì)樂(lè)觀的療效，而由于膀胱癌細(xì)胞具有增殖凋亡不受控、易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，患者在病情嚴(yán)重時(shí)，臨床治愈率顯著降低且預(yù)后不佳〔1～3〕。因此，膀胱癌細(xì)胞的惡性增殖遷移及非正常凋亡是影響臨床治療效果的關(guān)鍵因素，而在現(xiàn)階段對(duì)于癌細(xì)胞失控行為的具體機(jī)制尚在研究階段，可以明確的是，這是多細(xì)胞因子共同調(diào)控的結(jié)果，圍繞膀胱癌細(xì)胞的發(fā)展機(jī)制展開(kāi)深入探究對(duì)于臨床治療和患者生存率的提高均具有重大意義〔4〕。miRNA是近年來(lái)研究較多的非編碼RNA，其種類眾多且被發(fā)現(xiàn)能夠參與細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化 、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為和過(guò)程〔5〕。相關(guān)研究證明，miR-144-3p能夠?qū)侨饬黾?xì)胞增殖、侵襲能力進(jìn)行抑制，且低表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞中，上調(diào)其表達(dá)能夠有效降低胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲效率，此外，miR-144-3p還被證明能夠通過(guò)調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)8通路發(fā)揮腎細(xì)胞癌抑癌基因作用，因此，miR-144-3p在膀胱癌細(xì)胞發(fā)展過(guò)程的作用也值得探究〔6,7〕。三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族成員(ABCG)2被發(fā)現(xiàn)與胃癌、腸癌、食管癌等多種腫瘤臨床預(yù)后有關(guān)〔8,9〕，呂弢等〔10〕發(fā)現(xiàn)miR-144-3p能夠靶向調(diào)控ABCG2通路的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移侵襲。本研究旨在探究miR-144-3p通過(guò)調(diào)控ABCG2通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移作用的影響。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 人膀胱癌T24細(xì)胞株、正常膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞株(南京科佰生物科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(南京生航生物技術(shù)有限公司)、0.05%胰酶溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)、CCK-8試劑(北京緣生化科技有限公司)、結(jié)晶紫染液(湖北鑫鳴泰化學(xué)有限公司)、ABCG2一抗、ABCG2二抗(上海晶抗生物工程有限公司)、明膠酶譜檢測(cè)試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)、考馬斯亮藍(lán)染液(上海哈靈生物科技有限公司)、Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)、流式細(xì)胞儀、高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼)、倒置顯微鏡(廣州明美光電技術(shù)有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人膀胱癌T24細(xì)胞株和正常膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞株分別接種在含有10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基的不同培養(yǎng)瓶中，然后放置在CO2濃度為5%室溫且濕度條件適宜的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，兩種細(xì)胞的融合度達(dá)到80%以上添加濃度為0.25%的胰酶進(jìn)行細(xì)胞的消化，消化后的細(xì)胞傳代培養(yǎng)3代后備用。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將傳代培養(yǎng)結(jié)束的T24細(xì)胞接種于6孔板(密度為1×104/孔)，并于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明開(kāi)始轉(zhuǎn)染操作，將細(xì)胞分為三組：轉(zhuǎn)染miR-144-3p模擬物的T24細(xì)胞為miR-144-3p mimics組；轉(zhuǎn)染miR-144-3p抑制劑的T24細(xì)胞為miR-144-3p inhibitor組；轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列的T24細(xì)胞為miR-144-3p NC組，轉(zhuǎn)染操作完成后將細(xì)胞培養(yǎng)于不含小牛血清DMEM培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3qPCR法檢測(cè)miR-144-3p表達(dá) qPCR法檢測(cè)T24和SV-HUC-1細(xì)胞中miR-144-3p表達(dá)及轉(zhuǎn)染步驟完成后各組T24細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)。首先進(jìn)行總RNA的提取，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的具體操作完成cDNA的合成，U6為內(nèi)參進(jìn)行qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95℃ 2 min、95℃ 30 s、70℃ 40 s、70℃ 50 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后70℃ 10 min。以2-△△Ct法進(jìn)行miR-144-3p相對(duì)表達(dá)的計(jì)算，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)取平均值。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 按密度為1×104/孔接種各組細(xì)胞于96孔板上，并分別于培養(yǎng)的0、24、48、72 h時(shí)添加CCK-8試劑進(jìn)行染色，室溫孵育1 h后對(duì)每孔490 nm處OA值進(jìn)行測(cè)定，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)取平均值，并進(jìn)行細(xì)胞增殖曲線的繪制。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將各組T24細(xì)胞進(jìn)行1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)試劑反復(fù)清洗，結(jié)合緩沖液進(jìn)行清洗后1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，重懸細(xì)胞后避光條件下添加5 μl 的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V，作用10 min后添加5 μl 7-氨基放線菌素(AAD)，在1 h之內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移 各組T24細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h時(shí)用胰酶消化，經(jīng)過(guò)重懸制單細(xì)胞懸液，以5×103/孔T24細(xì)胞鋪于Transwell上室，下室培養(yǎng)基中添加20%小牛血清，將小室于培養(yǎng)箱中孵育1 d后取出小室，棉簽擦去上室的細(xì)胞和碎片，以0.1%的結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS洗滌后用倒置顯微鏡觀察下室濾膜上黏附的T24細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，比較各組細(xì)胞的遷移能力。

1.2.7Western印跡檢測(cè)ABCG2蛋白表達(dá) 提取總蛋白后二喹淋甲酸(BCA)法定量后以40 μg樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后添加5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，添加ABCG2一抗后低溫孵育過(guò)夜后添加ABCG2二抗孵育1 h，進(jìn)行顯色曝光、采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參運(yùn)用Gel-Pro32軟件分析T24細(xì)胞中ABCG2相對(duì)表達(dá)。

1.2.8明膠酶譜檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性 通過(guò)明膠酶譜檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP-2及MMP-9的活性。將各組T24細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h時(shí)的培養(yǎng)上清液與SDS上樣緩沖液進(jìn)行混合，進(jìn)行凝膠電泳的條件為電壓70 V電泳時(shí)長(zhǎng)2 h，電泳結(jié)束后用3.0%的Tritonx洗膠。然后于分析液中孵育過(guò)夜，考馬斯亮藍(lán)染色2 h后于脫色液中進(jìn)行0.5 h的脫色，再以濃度為0.8%的乙酸脫色，最后明膠酶活性于藍(lán)色背景出現(xiàn)光亮區(qū)域。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同細(xì)胞中miR-144-3p、ABCG2的表達(dá) miR-144-3p在人膀胱癌T24細(xì)胞中的表達(dá)較正常膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞顯著降低(0.51±0.05 vs 1.31±0.07；t=6.347，P<0.05)；ABCG2在人膀胱癌T24細(xì)胞中的表達(dá)較正常膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞顯著升高(3.12±0.34 vs 0.99±0.10；t=6.836，P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染后各組miR-144-3p的表達(dá) 經(jīng)檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后miR-144-3p mimics組膀胱癌T24細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)(1.36±0.05)較miR-144-3p NC組顯著升高(0.52±0.04，P<0.05)；miR-144-3p inhibitor組膀胱癌T24細(xì)胞中miR-144-3p的表達(dá)(0.37±0.03)較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)。

2.3各組T24細(xì)胞增殖能力比較 在轉(zhuǎn)染后的24、48、72 h時(shí)，各組膀胱癌T24細(xì)胞的增殖能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，與miR-144-3p NC組比較，miR-144-3p mimics組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，miR-144-3p inhibitor組細(xì)胞的增殖能力顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4各組T24細(xì)胞凋亡率比較 miR-144-3p mimics組T24細(xì)胞凋亡率〔(49.11±9.29)%〕較miR-144-3p NC組顯著升高〔(16.28±3.77)%,P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor組T24細(xì)胞凋亡率〔(5.21±0.63)%〕較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 各組轉(zhuǎn)染不同時(shí)間A值比較

2.5各組T24細(xì)胞遷移能力比較 miR-144-3p mimics組T24細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)〔(64.12±5.28)個(gè)〕較miR-144-3p NC組顯著降低〔(105.48±12.16)個(gè)，P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor組T24細(xì)胞遷移能力〔(204.39±20.19)個(gè)〕較miR-144-3p NC組顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 各組T24細(xì)胞的流式細(xì)胞凋亡圖

圖2 細(xì)胞遷移能力顯微鏡下觀察(結(jié)晶紫染色，×100)

2.6各組ABCG2信號(hào)通路蛋白的表達(dá) miR-144-3p mimics組T24細(xì)胞中ABCG2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)；miR-144-3p inhibitor組T24細(xì)胞ABCG2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)較miR-144-3p NC組顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3、4。

表2 各組ABCG2信號(hào)通路蛋白的相對(duì)表達(dá)比較

1～3：miR-144-3p inhibitor組、miR-144-3p NC組、miR-144-3p mimics組，下圖同圖3 Western印跡檢測(cè)T24細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)

圖4 明膠譜試驗(yàn)檢測(cè)T24細(xì)胞中MMP-9、MMP-2的表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)，miRNA被研究證實(shí)其在機(jī)體的多種病理及生理過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用，不同種類的miRNA對(duì)腫瘤惡性疾病發(fā)揮的作用不一，并與相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白相互作用正向或負(fù)向調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、轉(zhuǎn)移〔11～15〕。miR-144-3p是miRNA眾多種類中的一種，經(jīng)過(guò)對(duì)其深入和廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其在癌癥發(fā)生、成骨分化、生長(zhǎng)發(fā)育及機(jī)體免疫反應(yīng)等過(guò)程中均有一定的調(diào)控作用，高表達(dá)的miR-144-3p能夠抑制胃癌、惡性膠質(zhì)瘤病、宮頸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的增殖及遷移侵襲行為〔16～18〕。ABCG2作為多種腫瘤的臨床檢測(cè)標(biāo)志物，被發(fā)現(xiàn)其在胃癌和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，并且與食管癌的病程發(fā)展和腫瘤分期關(guān)系密切，其下游MMP-2、MMP-9是MMP家族的成員，其促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力已得到多項(xiàng)研究的證實(shí)〔19，20〕。

本研究說(shuō)明miR-144-3p的低表達(dá)可能是膀胱癌的致病因素之一。ABCG2的高表達(dá)對(duì)于該病有促進(jìn)作用。膀胱癌細(xì)胞中miR-144-3p的高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞的遷移能力。miR-144-3p對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的一系列調(diào)控作用與其高表達(dá)抑制ABCG2通路表達(dá)有關(guān)。