成都部分地區斷奶犢牛腸賈第蟲感染情況調查及基因型分析

李青松

（四川省綿陽市經濟技術開發區動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

賈第蟲是一種最常見的寄生生物，可感染人類和多種動物［1］。根據宿主和形態學分類，賈第蟲被分為六個種，其中只有腸賈第蟲（又名藍氏賈第鞭毛蟲、十二指腸賈第蟲）可感染人類。腸賈第蟲的基因型復雜，根據遺傳學和表型，至少分為8 個集聚體（A～H）［2］。奶牛主要感染集聚體E，其次是集聚體A和B［3］。近年來許多對奶牛犢牛感染腸賈第蟲的相關研究顯示，奶牛犢牛斷奶前后腸賈第蟲的感染率存在差異，斷奶前后犢牛感染腸賈第蟲的基因型也有差異［4-14］。

本研究以成都部分地區（崇州、青白江、邛崍）奶牛場中的斷奶犢牛為研究對象，采用巢式PCR擴增腸賈第蟲β-賈第素（bg）基因、磷酸丙糖異構酶（tpi）基因和谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點，確定感染率，并對陽性樣品進行集聚體鑒定。隨后基于三個位點擴增出的序列，對斷奶犢牛腸賈第蟲進行亞型分析，最后建立系統發育樹。旨在為奶牛場防治腸賈第蟲感染以及腸賈第蟲人獸共患病的監測提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Power Soil?DNA Isolation Kit（糞便DNA提取試劑盒），2×Taq PCR Master Mix，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 在成都市崇州、青白江、邛崍的三個奶牛場采集圈養斷奶犢牛（2～12月齡）的新鮮糞便共計104份，每份糞樣約50 g，置于潔凈塑料采樣袋中，做好標記、編號，于4 ℃下保存備用。

1.3 樣品處理 取每份糞便樣品20 g，放入50 mL小燒杯中，加入適量蒸餾水，攪拌溶解并過濾。將濾液轉移到50 mL 離心管內，以3 000 r/min 離心5 min，緩慢棄去上清液，保留沉淀物，一部分沉淀物直接用于DNA提取，另一部分沉淀物儲存于2.5%重鉻酸鉀，并于4 ℃冰箱中保存。

1.4 DNA提取 樣品處理后得到含糞便及卵囊的沉淀物，按照Power Soil?DNA Isolation Kit 說明書提取樣本DNA。提取的DNA 置-20 ℃環境中保存。

1.5 PCR擴增 基于β-賈第素（bg）基因位點對所有樣品進行檢測，引物設計及擴增條件參照Sulaiman 等［15］的報道。基于β-賈第素基因鑒定出的陽性樣品，使用磷酸丙糖異構酶（tpi）、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點進行基因亞型鑒定，引物設計及擴增條件參照Appelbee 等［16］和Cacciò等［17］的報道。PCR反應體系均為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL（第1輪PCR 產物為第2 輪PCR 的模板）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測第2 套巢式PCR 產物，置于凝膠成像儀內，使用Image Lab Version 3.0 軟件成像拍照。

1.6 測序及分析 將PCR 陽性產物進行雙向測序，通過DNAMAN Version 8.0 軟件進行拼接。將測序結果在GenBank中經BLAST比對校正后，使用MEGA 7的NJ法構建系統發育樹。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增結果 基于巢氏PCR擴增β-賈第素（bg）基因位點、磷酸丙糖異構酶（tpi）基因位點、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點的目的基因條帶長度分別為511 bp、532 bp、520 bp。

2.2 斷奶犢牛腸賈第蟲感染情況 所采集的104 份樣品中共有42 份鑒定為腸賈第蟲陽性，總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個奶牛場的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），三個奶牛場皆發現了集聚體E和集聚體A感染。具體感染情況見表1。

表1 斷奶犢牛腸賈第蟲感染情況統計

2.3 bg、tpi和gdh基因序列分析 經過多次巢氏PCR擴增bg、tpi、gdh三個位點，分別擴增出11、8、9 條基因序列，分別發現6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13）。基因型和基因亞型檢測結果見表2。

表2 基于bg、gdh和tpi位點的腸賈第蟲基因型和基因亞型檢測結果

基于bg 基因位點，11 條序列中以A1（n＝2）和E1（n＝2）基因亞型為主。形成的6 種基因亞型在NCBI的序列登錄號分別為A1（KR051222）、E1（KT922247）、E2（KT922248）、E9（KY769091）、E11（KY769089）、E13（MF671880），據此構建出bg基因位點的系統進化發育樹。

基于tpi基因位點，8條序列中以A1（n＝3）和E3（n＝2）基因亞型為主。形成的5種基因亞型在NCBI 的序列登錄號分別為A1（KJ888991）、E3（KT922259）、E6（KY432850）、E15（KY432848）、E22（KY710748），據此構建出tpi基因位點的系統進化發育樹。

基于gdh基因位點，9條序列中以A1（n＝2）、E1（n＝2）和E10（n＝2）基因亞型為主。形成的6種基因亞型在NCBI 的序列登錄號分別為A1（KT922255）、E1（KY769096）、E8（KT369785）、E10（KT698971）、E12（KY432840）、E13（KY432838），據此構建出gdh基因位點的系統進化發育樹。

3 結論與分析

3.1 腸賈第蟲感染情況 我國斷奶犢牛感染腸賈第蟲的情況非常普遍，但感染率多數偏低。通過多基因位點分析結果可知，本研究中斷奶犢牛腸賈第蟲的總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個奶牛場的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），高于廣東（0.94%）［7-8］、吉林（4.39%）［9］、寧夏（2.53%）［9］、江蘇（7.48%）［10］、河北和天津（3.48%）［11］、河南（2.42%）［12］、陜西（17.54%）［13］、新疆（16.60%）［14］。表明這些場中斷奶犢牛感染腸賈第蟲的情況較為嚴重，可能是不同氣候生態條件、管理水平等因素綜合作用的結果。提示成都地區奶牛場中腸賈第蟲可能是一種常見的病原體，應當引起重視。

3.2 腸賈第蟲基因型情況 本研究在bg、tpi、gdh三個基因位點分別擴增出了11、8、9條基因序列，分別形成6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13），均為已知亞型，且主要為集聚體E，其次為集聚體A，此項結果與國內陜西［13］、新疆［14］地區的研究結果一致，故成都地區的奶牛場可參照這些地區的防控方法防治該病。通過系統發育樹分析，三個奶牛場中斷奶犢牛腸賈第蟲集聚體E 的遺傳種類多樣，可能與集聚體的遺傳重組有關。本研究發現的所有集聚體A均為A1亞型，這種亞型主要在動物身上發現，但也可以感染人類，這提示成都地區奶牛場腸賈第蟲感染具有人獸共患風險，應當引起高度重視。■