基于AGEs/RAGE/NF-κB 通路探討左歸降糖通脈方對大鼠腦微血管內皮細胞損傷的保護作用

李鈺佳，李定祥，張 熙，彭 珣，劉春華,鄧奕輝*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省第二人民醫院，湖南 長沙 410035）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝異常疾病。 2019 年國際糖尿病聯合會的統計結果顯示，全球糖尿病患病率為9.3%（4.63 億人），預計到2030 年，糖尿病患病率將增至10.2%（5.78 億人）[1]。糖尿病因其病因復雜、病情控制不理想、并發癥多、致殘率及致死率高，目前仍需尋求多種有效治療方法及藥物。研究認為，慢性高血糖引起的體內各種糖基化蛋白的過量堆積所形成的晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products, AGEs）是造成糖尿病血管病變的主要因素之一[2]。 AGEs 是由蛋白質、 核酸和脂質非特異性糖基化結合形成的穩定不可逆的終末產物[3]。AGEs 可通過結合晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products, RAGE）、破壞正常的分子構象、促進交聯、改變酶的活性、 損害受體識別等來影響血管的正常功能[4]。 AGEs 通過與RAGE 結合，誘導核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）的活化，激活一系列下游信號通路，上調炎癥因子如白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α, TNF-α）、 細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1 （vascular adhesion molecule-1, VCAM-1）等的釋放，最終引起血管壁的損傷，誘發一系列血管并發癥[5]。 大量研究認為，抑制RAGE 活性能阻斷炎癥反應發生途徑， 該結論提示RAGE 可能成為糖尿病相關炎癥反應通路中的潛在作用靶點，抑制AGEs/RAGE/NF-κB 通路的激活可成為治療糖尿病腦血管疾病的潛在作用機制[6]。 左歸降糖通脈方是中醫臨床有效方劑，臨床研究表明其對糖尿病腦血管并發癥的治療有顯著的療效[7]，但目前對該方作用于腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）的作用機制尚不明確。本實驗基于AGEs/RAGE/NF-κB 通路探討左歸降糖通脈方對AGEs 誘導BMECs 損傷的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞和動物 實驗細胞株選用原代大鼠BMECs，購自武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，批號：RAT-CELL-0039。

SPF 級健康雄性SD 大鼠30 只，鼠齡42 d，體質量（220±20） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，于湖南中醫藥大學動物實驗中心內飼養。 大鼠均采用無菌顆粒飼料飼養，自由飲水，環境溫度穩定在20～25 ℃，室內通風良好，定時更換墊料。 所有操作符合實驗動物倫理學要求，已通過湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理審查，倫理審查編號：LL202060301。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 左歸降糖通脈方的方劑組成：熟地黃20 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，黃芪30 g，黃連10 g，地龍12 g，丹參20 g，川芎12 g，水蛭8 g，石菖蒲8 g。 共144 g，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。 采用水煎法，水煎2 次后合并煎液，過濾藥渣濃縮至含生藥2 g/mL，4 ℃冰箱中儲存備用。 尼莫地平片（20 mg/片，正大青春寶藥業有限公司，國藥準字：H33022285，批號：BJ57178）；格列齊特緩釋片（30 mg/片，施維雅制藥有限公司，國藥準字：H20044694，批號：1182108109）；RAGE抑制劑(FPS-ZM1)、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨（pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, PDTC）（美國Med-ChemExpress 公司，批號：945714-67-0、5108-96-3）。

原代細胞培養體系（武漢原生原代生物醫藥科技有限公司，批號：MED-SUP-0002）；人血清白蛋白、吩嗪硫酸二甲酯（美國Sigma 公司，批號：061M700V、P9625）；D-葡萄糖、透析袋（北京索萊寶科技有限公司，批號：G8150、YA1045）；青霉素、慶大霉素（大連美侖生物科技有限公司，批號：N0521A、J0520A）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所，批號：21208262）；兔抗RAGE 抗體（英國Abcam 公司，批號：ab3611）；兔抗NF-κB 抗體（美國CST 公司，批號：8242）；山羊抗兔IgG、β-actin 抗體（美國Proteintech 公司，批號：SA00001-2、60008）；TRIzol（美國Invitrogen 公司，批號：15596018）；逆轉錄試劑盒（北京康為世紀科技有限公司，批號：CW2020S）。引物由上海生物工程公司合成。

高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5910R）；倒置顯微鏡（德國Olympus 公司，型號：IX51）；電泳儀、電泳槽、熒光定量RCP 儀（美國Biorad 公司，型號：164-5050、165-8000、1855195）；轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-40A）；多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號:Cytation3）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52AA）。

1.2 方法

1.2.1 BMECs 原代細胞的培養 原代細胞培養體系培養，加入胰蛋白酶1 mL 覆蓋于細胞后吸出消化液，作用1～3 min，倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓變亮后與胰蛋白酶脫離、棄去，加入2 mL 完全培養液終止消化，用吸管輕輕吹打培養瓶底部，至細胞脫落，15 mL 離心管中離心（離心半徑17.8 cm，800 r/min，5 min），吸去上清液。 加入2 mL 培養液，以1 mL的Tip 頭上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，轉移至新的培養瓶中，每個培養瓶再加完全培養基,置于37 ℃含5% CO2的培養箱中培養。 每1～2 天換液1 次，取傳代至4～5 代生長狀態良好的細胞用于正式實驗。

1.2.2 體外制備AGEs AGEs 的體外制備參照糖孵育法[8]，在含100 mmol/L 的D-葡萄糖、200 mg/L的青霉素、70 μg/L 慶大霉素和1.5 mmol/L 吩嗪硫酸二甲酯的磷酸緩沖液（100 mmol/L）中加入人血清白蛋白，于37 ℃恒溫箱孵育8 周。 以相同條件但不含葡萄糖的緩沖液孵育的人血清白蛋白作為對照。 孵育結束后以無菌的透析袋置于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，透析24 h 除去未結合的D-葡萄糖，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 空白血清及含藥血清的制備 SD 大鼠適應性喂養1 周，根據體質量按照隨機數字表法分為空白組、左歸降糖通脈方組和尼莫地平+格列齊特組，每組10 只。左歸降糖通脈方組的灌胃劑量按動物體表面積劑量換算法[9]，以60 kg 成人2 倍臨床等效劑量的藥液灌胃[36 g/(kg·d)，即4 mL/d]，每天1次，持續5 d；尼莫地平+格列齊特組給予尼莫地平片及格列齊特緩釋片灌胃，將尼莫地平片及格列齊特緩釋片研磨成粉末，加入超純水配成終濃度分別為2 mg/mL、3 mg/mL的溶液，以60 kg 成人2 倍臨床等效劑量灌胃，分別為18.35 mg/(kg·d)、27.5 mg/(kg·d)[10]，共4 mL/d；空白組予以相同體積的蒸餾水灌胃。 末次灌胃前禁食12 h，待末次灌胃1 h 后，無菌條件下腹主動脈采血。將所采集的血清置于4 ℃冰箱過夜，待充分凝固后離心（離心半徑17.8 cm，3000 r/min，15 min），取上清液，恒溫水浴鍋56 ℃水浴30 min，滅菌后存放于-80 ℃冰箱。

1.3 藥物干預及分組

參考課題組前期研究結果[11]，根據CCK-8 結果計算細胞存活率，選取最接近細胞半數抑制率的AGEs 濃度200 mg/L 作用24 h，左歸降糖通脈方含藥血清最高增殖率濃度5%作用24 h 為造模及給藥的最佳作用濃度及時間。 將貼壁70%～80%的BMECs 用胰蛋白酶消化至5 mL 離心管中，細胞計數后調節細胞濃度至104個/mL，細胞懸液隨機分成6 組后貼壁培養。 分組為空白組（BMECs+細胞培養液4 mL）、模型組（BMECs+200 mg/L AGEs 細胞培養液4 mL）、左歸降糖通脈方組（BMECs+200 mg/L AGEs 細胞培養液4 mL 作用24 h+5%左歸降糖通脈方含藥血清4 mL）、 尼莫地平+格列齊特組（BMECs+200 mg/L AGEs 細胞培養液4 mL 作用24 h+5%尼莫地平+格列齊特含藥血清4 mL）、FPS-ZM1 組（為RAGE 抑制劑，BMECs+FPS-ZM 預處理1 h+200 mg/L AGEs 細胞培養液4 mL 作用24 h）及PDTC 組（為NF-κB 抑制劑，BMECs+PDTC 預處理1 h+200 mg/L AGEs 細胞培養液4 mL 作用24 h）。

1.4 CCK-8 法檢測細胞存活率

將貼壁70%～80%的BMECs 用胰蛋白酶消化至5 mL 離心管中，細胞計數后將吹打混勻的細胞懸液濃度調節至1000 個/孔，接種于96 孔板中，孔內的細胞隨機分為4 組：空白組（BMECs+細胞培養液）、模型組（BMECs+200 mg/L AGEs 細胞培養液）、左歸降糖通脈方組（BMECs+5%左歸降糖通脈方含藥血清）、尼莫地平+格列齊特組（BMECs+5%尼莫地平+格列齊特含藥血清），每孔100 μL，另設僅加細胞培養液的空白孔作為對照。每組設6 個復孔，放入培養箱中培養24 h，待BMECs 充分貼壁后吸出孔內原細胞培養液，加入上述各組不同干預藥物，作用24 h，吸出AGEs，加入新鮮細胞培養液，再向每孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，在培養箱內繼續孵育1.5 h，用酶標儀測定其在450 nm 處的光密度(optical density,OD)值并進行統計學分析，計算各組細胞存活率。 細胞存活率計算公式：細胞存活率=（給藥組OD 值-空白孔OD 值）/（空白組OD 值-空白孔OD 值）×100。

1.5 Western blot 法檢測RAGE、NF-κB 蛋白表達

PBS 洗滌各組細胞1～2 次，加入RIPA 裂解液60 μL，冰上裂解30 min，用細胞刮子將裂解后的細胞刮下，低溫高速離心機4 ℃低溫離心（離心半徑17.1 cm，3000 r/min，15 min），取上清液。 采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；每孔上樣40 μg蛋白量，經緩沖液處理后加熱變性，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，先恒壓80 V 電泳30 min，待樣品至分離膠時，調整電壓至110 V 繼續電泳90 min；電轉移法將蛋白條帶轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜上，200 mA 轉膜，約2 h；用1×TBST 配制5%的脫脂奶粉，室溫封閉1 h；漂洗后分別加入兔抗RAGE 抗體（1∶1000）及兔抗NF-κB抗體（1∶1000），4 ℃冰箱過夜；1×TBST 洗3 次，每次10 min；加入山羊抗兔IgG（1∶5000），37 ℃恒溫箱孵育1 h；將洗好的膜用濾紙吸去表面液體，加入1 mL配制好的顯影液，放進化學發光凝膠成像儀中進行顯影，分析目的蛋白條帶的相對灰度值，目的條帶灰度值/內參條帶灰度值即為目的蛋白相對表達量。每個樣品重復3 次。

1.6 RT-PCR 法檢測RAGE、NF-κB mRNA 表達

采用TRIzol 試劑提取各組細胞總mRNA。 按照試劑盒操作說明于PCR 儀中進行逆轉錄；反應完成后，按照說明進行擴增。反應條件為95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環。 每組取3個樣本，每個樣本3 個復管進行逆轉錄，確認PCR 的擴增曲線和熔解曲線，記錄各個基因的循環閾（cycle threshold, Ct）值。 以β-actin 作為內參，采用2-△△Ct法，計算mRNA 的相對表達量，每組重復3 次。 詳見表1。

表1 各基因引物序列表

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 AGEs 對BMECs 形態的影響

鏡下觀察BMECs 為梭形，單層貼壁生長，融合后呈“鵝卵狀”排列。鏡下可見正常細胞胞膜完整，細胞透光性較強；加入200 mg/L 的AGEs 作用24 h后，倒置顯微鏡下可見BMECs 形態發生明顯改變，細胞間隙增寬，細胞分離，胞膜皺縮、輪廓不清甚至破裂。 詳見圖1。

圖1 AGEs 對BMECs 形態的改變（倒置顯微鏡，×200）

2.2 各組細胞存活率比較

與空白組比較，模型組細胞存活率明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖通脈方組及尼莫地平+格列齊特組細胞存活率升高（P＜0.01）；與左歸降糖通脈方組比較，尼莫地平+格列齊特組細胞存活率降低（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組BMECs 中細胞存活率比較（±s，n=6）

表2 各組BMECs 中細胞存活率比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方組比較，＆P＜0.05。

組別空白組模型組左歸降糖通脈方組尼莫地平+格列齊特組存活率/%100.00±7.88 74.30±4.75**121.19±2.72**##107.82±1.53**##＆

2.3 各組RAGE、NF-κB 的蛋白表達水平比較

與空白組相比，模型組RAGE、NF-κB 蛋白表達水平明顯上調（P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖通脈方組、 尼莫地平+格列齊特組、FPS-ZM1 組及PDTC 組RAGE、NF-κB 的蛋白表達水平明顯下調（P＜0.05）；與左歸降糖通脈方組比較，尼莫地平+格列齊特組RAGE、NF-κB 及PDTC 組RAGE 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與尼莫地平+格列齊特組比較，FPS-ZM1 組RAGE、NF-κB 的蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與FPS-ZM1 組比較，PDTC 組RAGE 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。 詳見圖2、表3。

圖2 各組BMECs 中RAGE、NF-κB 的蛋白表達電泳圖

表3 各組BMECs 中RAGE、NF-κB 蛋白表達水平比較（±s，n=6）

表3 各組BMECs 中RAGE、NF-κB 蛋白表達水平比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方組比較，＆P＜0.05；與尼莫地平+格列齊特組比較，△P＜0.05；與FPS-ZM1 組比較，▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組左歸降糖通脈方組尼莫地平+格列齊特組FPS-ZM1 組PDTC 組RAGE 0.077±0.018 0.477±0.037**0.243±0.008**#0.187±0.016**##＆0.222±0.021**##△0.188±0.022**##＆▲▲NF-κB 0.128±0.038 0.428±0.012**0.253±0.035**##0.194±0.028**##＆0.249±0.029**##△0.206±0.022**##

2.4 各組RAGE、NF-κB mRNA 表達水平比較

與空白組比較，模型組RAGE、NF-κB mRNA表達水平明顯上調（P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖通脈方組、尼莫地平+格列齊特組、FPS-ZM1 組及PDTC 組RAGE、NF-κB mRNA 表達水平明顯下調（P＜0.05）；與左歸降糖通脈方組比較，尼莫地平+格列齊特組及PDTC 組RAGE mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與尼莫地平+格列齊特組比較，FPS-ZM1組RAGE mRNA 及PDTC組RAGE、NF-κB mRNA表達水平明顯升高（P＜0.05）。 詳見表4。

表4 各組BMECs 中RAGE、NF-κB 的mRNA 表達水平比較（±s，n=6）

表4 各組BMECs 中RAGE、NF-κB 的mRNA 表達水平比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方組比較，＆P＜0.05，＆＆P＜0.01；與尼莫地平+格列齊特組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別空白組模型組左歸降糖通脈方組尼莫地平+格列齊特組FPS-ZM1 組PDTC 組RAGE 0.778±0.214 12.354±1.200**8.580±0.479**#4.470±0.141**##＆＆6.763±0.525**#△6.336±0.354**##＆△NF-κB 1.034±0.044 3.072±0.246**1.992±0.187*#1.365±0.101*##1.754±0.162*##1.635±0.103**##△△

3 討論

AGEs 能介導內皮細胞、平滑肌細胞和單核吞噬細胞等細胞的促炎作用并誘導氧化應激，是引起糖尿病及其并發癥發生、發展的主要因素[12]。 AGEs作用于機體導致疾病發生的途徑有多種，目前認為受體途徑是引起血管內皮損傷導致疾病發生的最主要途徑[4]。 RAGE 是AGEs 的主要作用受體，當細胞或局部組織處出現RAGE 的配體或炎癥因子聚集時，可上調RAGE 的表達。 NF-κB 是一種蛋白質復合物，是促炎癥因子的轉錄因子之一，能對有害的細胞刺激，如感染、炎癥反應等作出迅速的反應[13]。當細胞處于靜息狀態時，NF-κB 與其抑制分子相結合，以非活化的狀態存在于胞質中；NF-κB 被促炎癥因子、細菌成分、病毒等刺激后，NF-κB 復合物發生磷酸化并降解，激活后的NF-κB 發生核轉移，與下游靶基因的增強子位點結合，啟動靶基因的轉錄和表達，激活下游信號通路，誘導各種炎癥反應的發生并釋放炎癥因子，破壞了血管內皮細胞的正常生理功能及形態結構，最終造成血管細胞的損傷[14]。NF-κB 參與了AGEs 介導的多條信號通路，在與AGEs 相關的炎癥反應中起著關鍵作用。RAGE 的激活能活化靜息狀態下的NF-κB，活化后的NF-κB又能上調RAGE 的活化和表達，形成反饋調節系統，放大炎癥反應效應。 糖尿病患者長期的高血糖狀態引起血液中AGEs 含量的增多，RAGE 表達上調，激活NF-κB，誘導釋放多種炎癥因子，造成不同程度的血管內皮損傷，從而引起血管并發癥的發生[15]。

糖尿病血管并發癥包括各種大血管及微血管并發癥，大血管在體內直行分布，運輸血液溝通上下，微血管為大血管的分支，呈網狀分布于全身，將營養物質運輸至各組織器官。 在生理結構及功能上，大血管類似于中醫的“經脈”，微血管類似于中醫的“絡脈”，共同構成了人體的經絡網絡體系[16-17]。 基于中醫絡病學理論，現代醫家認為糖尿病血管并發癥的病位在脈絡，痰瘀阻滯，日久化熱，瘀、熱、痰等多種病理產物在絡脈中相互膠結，合而為毒，糖尿病性腦病的主要病機為絡脈瘀結，毒損腦絡[18]。 消渴日久，氣血日益虧虛，氣血運行無力，久則化瘀，加之消渴病本為陰虛燥熱，陰虛津虧則瘀愈甚，津凝為痰，痰瘀互結，阻滯脈絡則發而為病[19-20]。 左歸降糖通脈方由左歸丸加減化裁而來，滋陰益氣、化瘀解毒，使祛瘀而不傷正、扶正而不留滯。 前期研究證明，該方可對抗實驗性糖尿病大鼠的脂質過氧化對機體的損傷，能顯著緩解糖尿病合并腦血管并發癥患者的臨床癥狀，改善糖尿病并發腦梗死患者的神經功能缺損，并在一定程度上抑制炎癥反應的發生和發展，具有良好的降糖、降脂、抗炎等作用[7]。

本課題組前期研究了AGEs 對人靜脈內皮細胞及BMECs 的影響，認為其對內皮細胞的損傷作用主要為炎性損傷[8]，為了證實中藥復方的有效性，選擇尼莫地平片+格列齊特緩釋片作為陽性對照藥物[10]。 既往研究表明，隨著濃度的增加和作用時間的延長，一定濃度的AGEs 可造成細胞不可逆損傷，釋放IL-1β、ICAM-1、VCAM-1 等炎癥因子[11]。 倒置顯微鏡下可見加入AGEs 后，BMECs 結構遭到明顯破壞，提示糖尿病患者體內持續的血管內皮高糖狀態導致BMECs 活力下降、損傷甚至死亡。Western blot及RT-PCR 結果表明，與加入了AGEs 的受損細胞的模型組相比，左歸降糖通脈方含藥血清能明顯降低細胞內RAGE、NF-κB 蛋白及mRNA 的表達；通過各藥物組與模型組之間的比較以及藥物組間的比較發現，左歸降糖通脈方組、尼莫地平+格列齊特組、FPS-ZM1 組和PDTC 組細胞的RAGE、NFκB 蛋白和mRNA 的表達水平均出現不同程度的降低，其中左歸降糖通脈方組表達水平的下降程度與FPS-ZM1 組更為接近，由此可以推測左歸降糖通脈方含藥血清干預BMECs 的作用機制可能與FPSZM1 的作用機制更為接近。 FPS-ZM1 和PDTC 分別抑制了下游炎癥反應信號通路發生的兩個作用階段，即AGEs 與RAGE 的結合以及NF-κB 的激活。 FPSZM1 是高親和力的RAGE 抑制劑，可在高糖環境中通過抑制RAGE 的表達抑制神經炎癥反應的發生[21]。 PDTC 是一種可以通透細胞膜的NF-κB 活化抑制劑，能直接抑制NF-κB 信號通路的激活及下游信號的傳遞，阻斷多種炎癥反應的發生[22]。本研究結果提示，左歸降糖通脈方干預AGEs 損傷BMECs可能是通過直接阻斷AGEs 與膜蛋白受體RAGE 的結合，進而抑制下游關鍵因子NF-κB 的活化，阻斷下游信號的傳遞，抑制炎癥反應的發生和炎癥因子的釋放，降低AGEs 對BMECs 的炎性損傷。RAGE阻滯劑和NF-κB 抑制劑兩組之間的蛋白和mRNA的表達較為接近，這可能是由于NF-κB 與RAGE 之間存在反饋調節機制，以至于兩組間差異不明顯。

綜上所述，本研究證明左歸降糖通脈方能有效抑制AGEs 對BMECs 的炎性損傷，其作用機制可能是通過抑制AGEs 與RAGE 的結合，抑制了AGEs/RAGE/NF-κB 通路，并下調了炎癥因子的釋放，從而對BMECs 起到保護作用。