天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用

吳苗苗，王惠芹，馮聚玲，苑玉和，石建功，陳乃宏*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所＆ 天然活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050；2.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208）

帕金森病（Parkinson diseases, PD）是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，以靜止震顫、肌肉強(qiáng)直、運動遲緩和共濟(jì)失調(diào)等為主要臨床表現(xiàn)，這些運動癥狀嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1-2]。 流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，PD 患病率在過去的20 年內(nèi)增加了一倍多，已經(jīng)成為增長速度最快的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[3]。 目前， 臨床治療PD 的大多數(shù)藥物能很好地控制3～6年的癥狀，但不能阻止疾病的進(jìn)程，過了這一時期，疾病發(fā)展加速，藥物治療往往達(dá)不到理性效果[2-4]。因此，研究開發(fā)治療PD 的新藥成為迫切需要解決的問題。

天麻為蘭科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Blume 的塊莖，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲對PD 患者具有較理想的療效[5-6]。 天麻主要活性成分天麻素對體內(nèi)、體外PD 模型具有改善作用[7-9]。 天麻聯(lián)芐類化合物32 是從天麻中提取分離得到的新型聯(lián)芐類化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1。 對天麻聯(lián)芐類化合物32 的生物活性研究尚未見報道，但有研究報道其同類型化合物20C 顯示出很好的神經(jīng)保護(hù)作用，具有抗凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等生物活性[10-13]。 本文研究天麻新型聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型的影響。

圖1 天麻新型聯(lián)芐類化合物32 的結(jié)構(gòu)式

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

PC12 細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理室傳代并保存。

1.2 試劑和藥品

DMEM（美國Gibco 公司，批號：12800-017-90482）；馬血清（美國Hyclone 公司，批號：16050-122-979412）；魚藤酮（批號：R8875）、噻唑藍(lán)[3-（4,5-dimethyhhyhhiazol-2-y1)-2,5-diphenyhetrazolium bromide，MTT]（批號：11465007001）均購自美國Sigma 公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒（批號：556547）、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（批號：C2006）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）檢測試劑盒（批號：S0033S）均購自碧云天生物技術(shù)研究所。天麻聯(lián)芐類化合物32 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植物化學(xué)合成室提供。

1.3 實驗儀器

MultiskanGo 型酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；IX70-142 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；2K15型通用臺式冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；FACS Calibur 型流式細(xì)胞分析儀（美國Becton Dickinson公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

PC12 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含5%胎牛血清、5%馬血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的孵育箱中孵育，每隔48 h 更換培養(yǎng)基，當(dāng)單層培養(yǎng)細(xì)胞匯合80%以后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒灐?實驗時將PC12 細(xì)胞傳入96 孔或6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁且生長狀態(tài)良好時，更換培養(yǎng)基。 將細(xì)胞分為對照組、模型組、天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）組，共5 組。對照組更換正常培養(yǎng)基，模型組通過加入含有4 μmol/L 魚藤酮的培養(yǎng)基損傷PC12 細(xì)胞48 h 建立PD 體外模型，天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）組更換含有4 μmol/L 魚藤酮和天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的培養(yǎng)基，孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行相關(guān)檢測實驗。

2.2 細(xì)胞于MTT 法檢測細(xì)胞存活率

細(xì)胞于96 孔板培養(yǎng)48 h 后，于每孔加入10 μL的MTT，37 ℃、5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，震蕩搖勻至晶體顆粒溶解，靜置10 min，570 nm 在酶標(biāo)儀上測定吸光度（A）值。 細(xì)胞存活率=實驗組平均A 值/對照組平均A 值×100%。

2.3 Annexin V-FITC/PI 染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)48 h 后，使用0.25%胰酶消化，懸浮于無血清DMEM 中，4 ℃、800×g離心5 min，預(yù)冷PBS 清洗1 次， 細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer 中，加入10 μL Annexin V-FITC 室溫避光反應(yīng)15 min，加入5 μL PI 和300 μL Binding Buffer，室溫反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.4 JC-1 染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位

細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)48 h 后， 用37 ℃無血清DMEM洗滌1 次，每孔加入1.5 mL 的JC-1（5 mg/L）染料，置于37 ℃、5% CO2孵育箱中反應(yīng)20 min，37 ℃無血清DMEM 漂洗2 次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 含量

細(xì)胞于6 孔板培養(yǎng)48 h 后，用PBS 緩沖液漂洗一次，每孔加入1.5 mL 的DCF-DA （終濃度為10 μmol/L），反應(yīng)30 min，棄去上清液，用PBS 漂洗兩次后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，檢測的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以“±s”表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞存活率的影響

與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率下降為（59.83%±5.27%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組相比，在誘導(dǎo)同時給予天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（1.0、10.0 μmol/L）可明顯增加魚藤酮損傷的PC12細(xì)胞的存活率，分別達(dá)到（67.22%±4.08%）和（88.71%±3.52%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。 詳見圖2。

圖2 各組細(xì)胞存活率比較（±s，n=6）

3.2 天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的影響

在檢測過程中對照組PC12 細(xì)胞有少量的損傷凋亡，模型組早期凋亡細(xì)胞數(shù)增加為17.67%。 在造模同時分別加入天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）后，早期凋亡細(xì)胞下降為11.02%、8.82%、9.63%，從而使活細(xì)胞比例增加。 上述結(jié)果提示天麻聯(lián)芐類化合物32 可在一定程度上抑制魚藤酮誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞早期凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。詳見圖3。

圖3 各組細(xì)胞凋亡情況

3.3 天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

對照組PC12 細(xì)胞呈均勻的強(qiáng)紅色熒光（99.29%±0.88%），線粒體膜電位水平較高，呈正常的狀態(tài)；與對照組相比，模型組紅色熒光強(qiáng)度減弱至（8.88%±2.07%），綠色熒光顯著增強(qiáng)至（91.12%±2.08%），細(xì)胞線粒體膜電位降低；與模型組相比，天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）組紅色熒光增強(qiáng)，綠色熒光顯著減弱，分別為（32.25%±6.80%）、（30.76%±7.31%）、（23.94%±2.12%），說明線粒體膜電位水平升高，提示天麻聯(lián)芐類化合物32 能抑制魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞的線粒體膜電位降低，維持線粒體穩(wěn)定，但不同濃度之間沒有顯著性差異。 詳見圖4。

圖4 各組細(xì)胞線粒體膜電位（±s，n=6）

3.4 天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞ROS 含量的影響

對照組綠色熒光強(qiáng)度較弱，ROS 含量較少，而與對照組相比，模型組綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量顯著增多（P＜0.001）；與模型組相比，天麻聯(lián)芐類化合物32 不同濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）組綠色熒光強(qiáng)度顯著減弱，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量均顯著減少（P＜0.001）。 結(jié)果表明天麻聯(lián)芐類化合物32 能顯著降低魚藤酮引起的ROS 含量，具有一定的抗氧化作用。 詳見圖5。

圖5 各組ROS 含量比較（±s，n=6）

4 討論

PD 的主要病理變化為黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡或缺失，雖然其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但有研究表明線粒功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等與PD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2，14]。 魚藤酮是實驗室常用的一種神經(jīng)毒制劑，能夠通過引起線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，廣泛用于PD 細(xì)胞模型的制備[15-16]。 PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆的細(xì)胞株，能表達(dá)酪氨酸羥化酶并合成多巴胺，是研究多巴胺能神經(jīng)元常用的細(xì)胞系[17-18]。 因此，本實驗以魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞建立PD 體外模型，研究天麻聯(lián)芐類化合物32 的神經(jīng)保護(hù)作用。

在細(xì)胞凋亡過程中，許多事件的發(fā)生都與線粒體密切相關(guān)，包括線粒體膜的通透性改變和跨膜電位降低，造成電子的漏出和自由基的產(chǎn)生，特別是增加細(xì)胞內(nèi)ROS 生成，增加氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡[19-20]。 線粒體膜電位降低是發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期的事件，因此改善線粒體功能可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21]。本研究首先通過MTT 法檢測細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，經(jīng)魚藤酮損傷后，PC12 細(xì)胞的存活率顯著降低，出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，而天麻聯(lián)芐類化合物32 能夠提高損傷PC12 細(xì)胞的存活率，抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 但同時也發(fā)現(xiàn)不同濃度天麻聯(lián)芐類化合物32 對細(xì)胞凋亡影響的差異不明顯，這可能與實驗操作過程對細(xì)胞的損傷有關(guān)，或許細(xì)胞凋亡并不是天麻聯(lián)芐類化合物32 改善魚藤酮損傷PC12 細(xì)胞存活率的關(guān)鍵影響因素，這還需要進(jìn)一步的研究。

JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的特異性熒光染料，線粒體膜電位較高時，聚集在線粒體基質(zhì)中，產(chǎn)生紅色熒光；線粒體膜電位較低時，以單體形式存在于線粒體胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光，據(jù)此可判斷線粒體膜電位的變化[22]。 本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮損傷細(xì)胞后綠色熒光顯著增強(qiáng)，紅色熒光減弱，說明細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著下降；天麻聯(lián)芐類化合物32 能顯著降低綠色熒光、增強(qiáng)紅色熒光，提高線粒體膜電位水平，但各濃度組之間沒有顯著差異。

魚藤酮抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，導(dǎo)致電子的泄露和ROS 的產(chǎn)生，大量自由基可以損傷線粒體功能自身，線粒體功能障礙又會生成更多的自由基，二者互為因果，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23-25]。 本研究利用熒光探針DCFH-DA 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，綠色熒光增強(qiáng)說明細(xì)胞內(nèi)ROS 含量增加，魚藤酮損傷后細(xì)胞綠色熒光顯著增強(qiáng)，而天麻聯(lián)芐類化合物32 可以顯著降低ROS 的水平，具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

綜上所述，天麻聯(lián)芐類化合物32 對魚藤酮損傷的PC12 細(xì)胞具有保護(hù)作用，能降低線粒體膜電位水平，減少氧化應(yīng)激，穩(wěn)定線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡，是潛在的神經(jīng)保護(hù)劑。 天麻聯(lián)芐類化合物32 在本研究中顯示出較強(qiáng)的抗氧化作用，或許與其神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)，但還需進(jìn)一步研究。