基于以方測證的膝骨關節炎風寒濕痹證模型大鼠構建研究

余曉愉，熊 輝*，齊新宇，向黎黎，曾 朋，張 娟

（1.湖南省胸科醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；4.湖南中醫藥大學湘杏學院，湖南 湘陰 414600）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis, KOA）是在生物學和力學等各種因素的影響下，致使膝關節軟骨細胞、 細胞外基質及軟骨下骨三者結構和功能失衡所引起的一種臨床常見的退行性病變[1-3]。 隨著經濟的進步、 人的預期壽命增加及超重等原因，KOA 的患病率逐年增加，65 歲以上者發病率達50%以上，已成為中老年人慢性疼痛和下肢殘疾的主要原因之一[4]。 不僅導致患者個人的生活質量下降，且增加了社會的經濟負擔。 “以方測證”的原理是依據方劑的藥物構成及功效，觀察應用該方劑后所出現的藥效反應，從而推測研究對象的所屬證型，是中醫學認識病證、用于證候動物模型研究的一種重要方法[5]。 近年來，許多學者從不同角度對KOA 進行了研究， 當前關于KOA 的研究主要以臨床觀察為主，其實驗研究尚不全面，關于KOA 病癥結合模型的研究較少[6]。 本實驗基于“以方測證”思維，模擬人KOA風寒濕痹證的發病機制，以期建立穩定的KOA 病證結合動物模型，為KOA 發病機制的研究提供便利條件。

1 材料

1.1 動物

健康SPF 級雄性SD 大鼠50 只，體質量（180±5） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：430727201101634326。 分籠飼養于湖南中醫藥大學科技創新實驗動物中心，室內溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，晝夜各12 h，使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。 本實驗符合動物倫理委員會要求，湖南中醫藥大學倫理委員會審批號：LL2020120203。

1.2 藥物與試劑

烏頭湯按《金匱要略》原方比例制備。 制川烏6 g、麻黃9 g、白芍9 g、甘草9 g 均購自亳州市京皖中藥飲片廠（批號分別為201001、211001、200101、210102），黃芪9 g（湖南聚仁中藥飲片有限公司，批號：21051801）。

木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司，批號：P15J11B118475）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：Q/12HB4218-2017）；4%多聚甲醛（廣州賽國生物科技有限公司，批號：70111800)；鼠腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）、鼠白細胞介素-17A（interleukin-17A, IL-17A）、 鼠白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）ELISA試劑盒均購自上海泛柯實業有限公司（批號分別為21022535N、21022531N、21022526N）。

1.3 儀器

無菌操作臺（蘇州市蘇杭科技器材有限公司，型號：SQ-120）；電子天平（日本AND 公司，型號：ER-182A）；智能人工氣候箱（上海汗諾儀器有限公司，型號：PRX-150B）；Micro-CT（美國PerkinElmer-Caliper LS 公司，型號：Quantum GX2）；電熱恒溫培養箱（太倉市華利達實驗設備有限公司，型號：DHP-9082)；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5810R）。

2 方法

2.1 藥物制備

先將蜂蜜及制川烏置于多功能提取罐中（采用1 g制川烏與66.67 mL 蜂蜜的比例混合），加入蒸餾水先煎1.5 h，然后加入其他4 味藥再煎煮1.5 h。濾出藥液，藥渣加蒸餾水再煎煮1.5 h，濾出藥液。將兩次藥液合并，60 ℃減壓濃縮制成烏頭湯100%標準湯劑（15 g/kg），滅菌、密封備用。

2.2 動物分組、造模及給藥

50 只大鼠稱量后編號，按照隨機數字表法分為5 組，即空白（A）組、單純風寒濕刺激（B）組、單純KOA 造模（C）組、KOA 造模+風寒濕刺激（D）組、烏頭湯灌胃（E）組，每組10 只。除A、B 組外，其余組均采用10%水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg），麻醉滿意后將大鼠左膝關節向后屈曲95°～100°，使關節腔間隙充分打開，關節腔處于最大位置，然后分別于第1、3、7 天注入2%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，A、B 組同法注射0.2 mL 生理鹽水。 造模2 周后，A、C 組隨機各取5 只大鼠，采用測量大鼠膝關節紅腫度及關節評分的方法進行模型判定[7-8]。 造模成功后，除A、C 組外，其余組于造模后1 d 開始置于改良的智能人工氣候箱中進行風寒濕刺激（風速5 m/s，溫度0～2 ℃，濕度90%～95%，4 h/d），直至實驗結束。在第1次造模后14 d 開始，E 組進行烏頭湯灌胃，直至實驗第45 天結束，灌胃量為每天15 g/kg，分2 次灌胃，每次2 mL，其余組以等量生理鹽水灌胃。

2.3 標本采集

末次灌胃后禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mL/g）各組大鼠，麻醉滿意后經腹主動脈采血，靜置離心（4 ℃，3500 r/min，10 min，離心半徑7 cm）后取上層淡黃色血清1.5～2 mL，于-80 ℃冰箱內保存，用于測定TNF-α、IL-1β、IL-17A 的濃度。 采血完畢后將大鼠放置于鼠板操作臺上，用刀片劃開膝關節周圍皮膚組織，逐層切開，充分暴露整個膝關節，剔除股骨上的肌肉組織，切斷內外側副韌帶及前后交叉韌帶，使股骨下端游離，用咬骨鉗在股骨近端離股骨髁約1.5 cm 處將其咬斷取下。將取出的股骨髁清理干凈后固定、脫鈣。

2.4 指標檢測

2.4.1 一般情況 參照文獻[9-11]，結合風寒濕痹證模型大鼠的一般臨床表現特征，觀察各組大鼠精神狀態、日常活動量、毛發光澤度、攝食進水情況以及大小便等情況。

2.4.2 病理學檢測分析及Mankin 評分 樣本脫鈣完成后，進行石蠟包埋、切片并行HE 染色觀察。PBS沖洗玻片3 次，每次15 min；乙醇梯度脫水，各5 min；二甲苯透明3 次，每次15 min，透明過程中每3 min觀察1 次組織狀態；蘇木素染色5 min；流水沖洗、鹽酸乙醇分色10 s，自來水浸泡，返藍5 min，置于伊紅溶液中染色3 min；乙醇梯度脫水，各2 min，再予以二甲苯透明，中性樹膠封片，常溫晾干；在光學顯微鏡下觀察各組大鼠膝關節玻片標本的軟骨結構、細胞、基質及潮線情況。

根據軟骨結構完整性、細胞數量、基質染色、潮線完整性進行評分及分期。 Mankin 評分標準[12]以軟骨結構、軟骨細胞、基質染色、潮線4 個方面為主。軟骨結構：結構正常為0 分，軟骨表面不規則為1分，有血管翳形成且表面不規則為2 分，出現裂隙且達到軟骨過渡層為3 分，裂隙達軟骨輻射層為4 分，裂隙達軟骨鈣化層為5 分，軟骨完全破壞為6分。軟骨細胞：數量正常為0 分，彌漫性細胞增加為1分，局部細胞數量增加為2 分，細胞數量減少為3分。 基質染色：正常為0 分，輕度減少為1 分，中度減少為2 分，重度減少為3 分，無著色為4 分。 潮線：完整為0 分，不完整、有血管穿過為1 分。 軟骨退變程度分期[13]：0～1 分為正常軟骨，2～6 分為早期，7～9 分為中期， 晚期為10～14 分。 最終評分分值越高，則說明關節軟骨的損傷越嚴重。

2.4.3 Micro-CT 檢測分析 灌胃結束后，麻醉并固定大鼠左膝關節，使用Micro-CT（分辨率為8.8 μm，每層厚度為9 μm）掃描大鼠膝關節位置，進行三維重建分析并評價關節骨組織損傷程度。

2.4.4 ELISA 法測定血清TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度 標準加樣和樣本加樣完成后在37 ℃溫度下孵育30 min，用配好的洗滌液進行洗滌，加入酶標試劑后再次溫育、洗滌，完成后加入顯色劑避光顯色15 min，然后加入終止液以終止反應，并在15 min以內，以空白孔為基礎調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度。

2.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件對所得的實驗結果進行數據分析。 計量資料用“±s”表示，符合正態分布及方差齊性的采用單因素方差分析，兩兩比較則采用LSD 法分析；若不符合方差齊性，則用Games-Howell 檢驗；不符合正態分布的采用多樣本秩和檢驗分析。 均以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

在造模前，各組大鼠精神狀態良好，日常活動自如，攝食飲水及大小便均正常。 造模后，C 組大鼠精神狀態及毛發光澤度尚可，日常活動減少，造模側膝關節屈伸不利，未見明顯肢體腫脹現象，喜臥懶動，攝食飲水量及二便正常。B、D、E 組較A 組出現不同程度精神萎靡、攝食飲水減少、日常活動量減少、毛發光澤度差、喜扎堆靜臥、大便質稀等風寒濕痹證臨床表現，D、E 組還伴隨造模側膝關節屈伸不利癥狀。E 組大鼠精神狀態、攝食飲水量、活動度及毛發光澤度等較D 組明顯改善。

3.2 病理學檢測分析及Mankin 評分

HE 染色結果：A、B 組軟骨淺表層完整無缺損，細胞形態數量正常，排列分布均勻，無簇集成團現象，基質染色正常，潮線完整；C、D、E 組軟骨淺表層均出現不同程度破損、軟骨形態數量改變、排列紊亂、細胞成簇聚集；C、E 組表層破壞，見少量受損，移行層相對完整，細胞增生且排列相對紊亂，基質染色輕度減少，潮線相對完整；D 組關節軟骨表層及切線層破損、裂隙達軟骨過渡層及軟骨質輻射層，細胞成簇聚集，排列紊亂無序，基質染色重度減少，潮線不完整。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠膝關節軟骨病理圖片（HE 染色，×100）

Mankin 評分結果：A、B 組為0～1 分，C、E 組4～7 分，為KOA 早中期；D 組為7～11 分，屬于KOA 中晚期。 C、D、E 組Mankin 評分較A 組及B 組均明顯升高（P＜0.05），C、E 組Mankin 評分較D 組均明顯降低（P＜0.05）。 B 組Mankin 評分與A 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 C、E 組間Mankin 評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠Mankin 評分比較（n=10，±s）

表1 各組大鼠Mankin 評分比較（n=10，±s）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，▲P＜0.05；與D 組比較，#P＜0.05。

組別A 組B 組C 組D 組E 組評分/分0 0.30±0.48 5.70±1.06*▲#9.00±1.25*▲5.30±116*▲#

3.3 Micro-CT 檢測分析

與A、B 組比較，C、D、E 組膝關節骨組織出現不同程度破壞、關節間隙變窄、關節出現變形，D 組膝關節骨組織破壞及關節間隙變窄嚴重，關節出現變形。 C、E 組膝關節軟骨及骨侵蝕較D 組輕，關節結構也相對完整。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠膝關節Micro-CT 圖像

3.4 血清TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度

B、C、D、E 組TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度較A組均明顯升高（P＜0.05），C、D、E 組TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度較B 組均明顯升高（P＜0.05），C、E 組TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度較D 組均明顯降低（P＜0.05）。 C、E 組間TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度比較（n=10，±s，ng/L）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度比較（n=10，±s，ng/L）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，▲P＜0.05；與D 組比較，#P＜0.05。

組別A 組B 組C 組D 組E 組TNF-α 382.61±7.50 403.31±3.92*440.88±6.79*▲#486.45±11.59*▲414.78±4.16*▲#IL-1β 39.87±0.79 41.47±0.65*51.41±0.65*▲#54.35±0.90*▲51.56±1.16*▲#IL-17A 14.99±0.43 16.62±0.39*20.38±0.84*▲#23.08±0.70*▲20.00±0.58*▲#

4 討論

KOA 屬中醫學“痹痛”“骨痹”“膝痹”范疇，以肝、脾、腎虧虛為本，以風、寒、濕、痰、瘀之實為標，病位在膝，屬本虛標實、本痿標痹之證[14]。 從發病學角度來看， 可將膝痹概括為 “正虛”“邪侵”“痰飲瘀血”。 引發三者出現的原因即是膝痹病的病因，而風寒濕痹則屬于外邪侵襲人體誘發的痹病。為模擬臨床KOA 病證結合模型，病因病理造模是運用最多的方式，中醫證型的評價主要是以遵循《醫學實驗動物學》中臨床表現與證型的對應為主[15]。中醫證型模型成功與否，最主要的評價標準為模型的整體狀態與臨床癥狀表現的一致性，因此，四診相關信息的表達可以作為中醫特色模型的評價標準。然而，動物模型的四診信息采集難度較大，且沒有統一、規范的評價標準，單純的病理病因造模不能完整體現中醫證候的病因或誘因，難以依據正向思維來辨析證型，更為適合的方式應是在現代醫學建?；A上施加中醫病因，并找到科學評價病證結合模型的各項指標，結合“病”+“證候”2 項指標進行綜合評估，結合多學科，如基因組學、代謝組學和蛋白組學等，從宏觀+微觀入手，運用方藥對模型的證候屬性進行反證和推測，這也是“以方測證”思維成為證候模型研究重要手段之一的原因[16]。

烏頭湯首見于張仲景《金匱要略》，有溫經散寒、除濕止痛之效，主治寒濕痹阻關節證。 研究表明，烏頭湯可顯著改善寒濕證患者關節疼痛、腫脹、晨僵等癥狀，延緩關節骨破壞，改善患者生活質量[17-19]。

因此，本實驗在綜合考慮KOA 模型建立的對象、造模方法的優缺點以及當前關于KOA 模型及風寒濕痹證各種經典的評價指標后，采用膝關節腔注射木瓜蛋白酶（2%，0.2 mL）+風寒濕外環境（風速5 m/s、溫度0～2 ℃、相對濕度90%～95%，人工智能氣候箱4 h/d），“病”+“證候”的造模方式，通過觀察大鼠一般情況、Mankin 評分、膝關節Micro-CT、關節軟骨的組織形態學變化及血清中TNF-α、IL-1β、IL-17A的檢測，并基于“以方測證”思維運用烏頭湯作為風濕寒痹證病證結合動物模型的“方證對應”論證方劑，具備一定的理論和臨床依據。 結合“病”+“證候”2 項指標進行綜合評估各項觀察指標。結果顯示，在KOA 模型的基礎上施加風寒濕外環境干預，造模大鼠表現出精神萎靡、日?；顒訙p少、關節屈伸不利等類似人體KOA 風寒濕痹證的表現，風寒濕外邪干預后，復合模型大鼠較單純KOA 模型大鼠的病情進展更快，程度更嚴重。使用治療寒濕痹痛的經方烏頭湯進行灌胃佐證發現，風寒濕外邪能夠使大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度升高（P＜0.05）；經灌胃后，D 組血清中TNF-α、IL-1β、IL-17A 濃度下降，與C 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 本實驗各項結果均提示，在現代醫學建?；A上聯合中醫基礎理論思想，將風寒濕外環境作用于KOA 模型大鼠，能夠模擬人KOA 風寒濕痹證的發展進程。