基于網絡藥理學及體內外實驗研究連翹不同提取液抗RSV 作用

王 平，馬元榮*，張會敏

（1.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；2.天津大學精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 300072；3.山東省濟南市長清區平安街道社區衛生服務中心，山東 濟南 250300）

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）隸屬副黏液病毒科肺炎病毒屬[1]，是誘發嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者呼吸道感染常見的RNA 病毒[2-3]。 感染發病率高，以不同程度的發熱、咳嗽、咽痛及呼吸急促為常見臨床癥狀[4]，若病情未得到及時有效的控制，極易發生哮喘、急性呼吸衰竭及心力衰竭，甚至死亡[5-8]。 臨床對RSV 患者常給予利巴韋林、干擾素治療[9]，但上述藥物療效有限，常出現發熱、過敏等不良反應[10-11]。目前RSV 感染的流行趨勢依舊嚴峻，至今尚無安全有效的疫苗和特效的防治方法。

中藥防控病毒性感染有著數千年的臨床實踐經驗[12]，除了直接殺滅病毒、抑制病毒復制、阻止病毒致細胞損傷外，還能減輕嚴重的炎癥反應、加強機體對病毒的免疫應答，同時具有毒副作用少、藥源豐富、價格低廉及抗毒譜廣等優勢[13-15]。 中藥連翹為中醫學中廣泛應用的一種清熱藥，無毒，安全性高[16]。《中華人民共和國藥典》記載，連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl 的干燥果實[17]。《本草圖經》中記載，連翹味苦，性微寒，歸肺、心、小腸經，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等功效，主要的藥效物質為連翹酯苷、揮發油、連翹苷等[18]。 田文靜等[19]發現連翹水提液抗RSV 活性存在明顯的量效關系，而且在不同感染時間給藥都能產生抑制作用。借助網絡藥理學系統地預測連翹抗RSV 的活性成分、潛在靶點、信號通路，并結合體內外實驗對連翹不同提取液抗RSV 活性進行初步驗證，獲得在體內外都有較好抗RSV 效果的連翹提取物，為研發高效抗病毒單體奠定基礎。

1 材料

1.1 主要的儀器設備

CKX41 型倒置顯微鏡（奧特光學儀器有限公司）；IL-161CT 型CO2培養箱（施都凱儀器設備有限公司）；SB5200DTS 型超聲波雙頻清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Allegla X-30R 型全能高速冷凍離心機（美國貝克庫曼爾特有限公司）；TDL-5-A 型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品及主要試劑

連翹經山東省中醫藥研究院生藥教研室鑒定；利巴韋林（批號：J1202A，大連美侖生物技術有限公司）。

磷酸鹽PBS 緩沖鹽溶液（批號：0025018）、胎牛血清（批號：1842926）、2% DMEM 維持液（批號：0021019）均購自以色列Biological Industries 公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（批號：20190430）、青霉素/鏈霉素混合液（批號：20181211）均購自北京索拉比奧科技有限公司； 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號：20180715，天津市富宇精細化工有限公司）；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）（批號：715F0522，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 實驗細胞與病毒

人肺癌細胞（A549）由山東省醫學科學院基礎所微生物室惠贈，于山東中醫藥大學病原微生物實驗室傳代后使用。

RSV 由山東省醫學科學院基礎所微生物室惠贈，-80 ℃保存于山東中醫藥大學病原微生物實驗室。

1.4 實驗動物

BALB/c 小鼠60 只，SPF 級，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（魯）2019-0003。

2 方法

2.1 連翹抗RSV 的機制研究[20]

2.1.1 活性成分的篩選及成分靶點的收集 搜集TCMSP 數據庫，以“連翹”為檢索詞，以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%且藥物相似性（drug likeness, DL）≥0.18 為條件， 初步篩選出活性成分。

活性成分輸入Open Babel 數據庫，將其結構轉化為SMILES，導入Swiss TargetPrediction 數據庫，設置物種為“Homo sapiens”，移除非人源、不規矩及重復靶點，將數據庫中靶點與化合物進行模擬對接，選取結果Probability＞0.5 的靶點建立數據庫。

2.1.2 RSV 靶點預測及網絡圖構建 以“RSV”為關鍵詞，在GeneCards、GenCLiP3 和NCBI 中搜索，刪除重復靶點，建立RSV 靶點庫。將活性成分-RSV 靶點導入Cytoscape 3.8.2，構建網絡圖。

2.1.3 富集分析 將連翹抗RSV 的作用靶點輸入DAVID 6.8 數據庫，進行GO 功能及KEGG 通路富集分析。

2.2 連翹不同提取液抗RSV 的體外實驗研究

2.2.1 供試品制備 煎煮液：精密稱取樣品，加6 倍量水，回流提取2 h，濾過，得到濃度為2 g/mL 的溶液。 超聲液：精密稱取樣品，加10 倍量水，超聲處理30 min，濾過，得到濃度為2 g/mL 的溶液。 煎煮、超聲離心液：吸取適量煎煮液及超聲液，8000 r/min，離心10 min（離心半徑18 cm）。 煎煮、超聲過濾液：吸取適量煎煮液及超聲液，用0.22 μm 濾膜過濾。利巴韋林溶液：精密稱取利巴韋林粉末，用PBS 配制成最終濃度為4 mg/mL 的溶液。

2.2.2 A549 細胞的復蘇和培養 將液氮罐內凍存的A549 細胞在37 ℃水浴鍋內晃動1 min，使其快速融化。 1000 r/min 離心5 min（離心半徑16 cm），棄掉上清液。 加適量的10% DMEM 培養液，反復吹勻，取適量懸液，轉入培養瓶，補加培養液至12 mL。放置于37 ℃、5% CO2恒溫培養，細胞長成單層后，加1 mL 0.25%的胰酶消化，1∶3 傳代。

2.2.3 RSV 擴增和保存 RSV 接種于A549 單層細胞上，1 h 后，加入12 mL 含2%胎牛血清的DMEM維持液，恒溫培養。 實時觀察細胞病變情況，待細胞病變出現80%以上時，取出后離心，1000 r/min 離心5 min（離心半徑16 cm），收集上清液，定量分裝，-80 ℃保存，備用。

2.2.4 病毒毒力測定 病毒液用2% DMEM 維持液10 倍比稀釋成8 個不同濃度梯度，依次接種在96 孔板內單層細胞上，縱向重復6 孔，設兩列細胞對照。培養3 d，每日觀察細胞病變情況。培養結束前4 h，棄廢液。 加入10 μL MTT 和100 μL PBS，置于恒溫培養箱4 h。 棄廢液，加200 μL DMSO，490 nm 波長檢測OD 值。 根據Reed-Muench 公式，計算病毒液半數感染劑量（TCID50）。

2.2.5 細胞毒性測定 連翹不同提取液用2%DMEM 維持液從原始濃度開始2 倍比稀釋成10 個梯度；分別接種于96 孔板內，接種量為50 μL/孔，重復4 孔，同設2 列空白對照；于37 ℃、5% CO2恒溫培養，每日觀察細胞病變情況，持續3 d。 棄掉廢液，加100 μL PBS 和10 μL MTT，培養箱內培養4 h；棄上清染液，加200 μL DMSO，490 nm 測定OD值，采用Reed-Muench 方法計算藥物半數毒性濃度（TC50）。

2.2.6 抗RSV 毒性測定[21]將配比好的連翹不同提取液及陽性藥利巴韋林橫向接種，50 μL/孔，重復4孔；除空白對照外，每孔接種50 μL 病毒液；每日觀察細胞病變情況，3 d 后，加入100 μL PBS 和10 μL MTT，培養箱內培養4 h；棄染液，加200 μL DMSO，490 nm 波長檢測OD 值。 用Reed-Muench 方法計算半數有效濃度（EC50）及治療指數（TI）。

2.3 連翹煎煮離心液抗RSV 的體內實驗研究

小鼠每側鼻腔內滴入35 μL 病毒液（100 個TCID50），正常組小鼠滴入等量的DMEM 維持液[22]，待小鼠完全吸入后放入籠中繼續觀察，連續滴鼻3 d，1 次/d[23]。

滴鼻3 h 后，觀察小鼠是否死亡，并灌胃給藥0.2 mL/15 g，1 次/d，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水[21]。 連續灌胃5 d，期間觀察并記錄小鼠的精神、活動、飲食等情況。

2.3.2 血常規測定 眼眶取血，血液滴入加有EDTA-2K 的EP 管，檢測白細胞（white blood cell,WBC）、淋巴細胞（lymphocyte count,LYM）、單核細胞（mononcyte, MON）、中性粒細胞（neutrophil, NEU）計數。

2.3.3 肺指數測定 取血結束后，脫頸法處死小鼠，摘取完整肺組織并稱重，計算出肺指數。肺指數=肺質量/體質量。隨后將肺組織處理，進行病理學檢測。

2.3.4 病理觀察 取相同大小同一位置的左肺，制備石蠟切片行HE 染色，顯微鏡觀察肺部病變情況并拍照記錄。

2.3.5 肺組織免疫組化檢測 石蠟切片行DAB 染色，脫水封片，置于顯微鏡下鏡檢，計算平均光密度值。

2.3.6 統計學分析 采用SPSS 17.0 統計軟件，計量資料用“±s”表示。多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 連翹抗RSV 的機制研究

篩選出21 個活性成分，抗RSV 潛在作用靶點129 個，詳見圖1。 GO 分析得到548 個條目，連翹參與的生物過程主要有基因表達的正調控、凋亡過程的負調控、藥物的反應、DNA 模板轉錄的正向調節等；在細胞成分中，主要涉及胞質溶膠、質膜部分等；分子功能主要包括酶結合、轉錄因子結合等，詳見圖2。 KEGG 分析篩選出作用通路共112 條，有癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路等相關通路，詳見圖3。

圖1 連翹抗RSV 靶點網絡圖

圖2 GO 富集分析圖

圖3 KEGG 信號通路分析圖

3.2 連翹不同提取液抗RSV 的體外實驗研究

3.2.1 RSV 半數感染劑量（TCID50） 培養72 h，根據病毒所致A549 細胞病變情況， 計算出RSV 的TCID50為10-3.77。

3.2.2 連翹不同提取液對RSV 的抑制作用 體外連翹不同提取液抗RSV 效果：煎煮離心液＞超聲離心液，超聲液、煎煮液較前兩者略差。 詳見表1。

表1 連翹不同提取液對細胞的毒性和抗RSV 活性

3.3 連翹煎煮離心液抗RSV 的體內實驗研究

3.3.1 各組小鼠血常規水平比較 與正常組相比，模型組WBC、LYM、MON 計數升高，NEU 計數下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，利巴韋林組、高劑量組、中劑量組、低劑量組WBC、LYM、MON 計數明顯下降，NEU 計數升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與利巴韋林組相比，中劑量組、低劑量組WBC、LYM、MON 計數升高，NEU 計數下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），高劑量組WBC、LYM 計數升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高劑量組相比，低劑量組WBC、LYM 計數升高，NEU 計數下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組小鼠血常規檢測結果(±s，n=10)

表2 各組小鼠血常規檢測結果(±s，n=10)

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與利巴韋林組相比，△P＜0.05；與高劑量組相比，▽P＜0.05。

組別正常組模型組利巴韋林組高劑量組中劑量組低劑量組WBC/（×109·L-1）2.31±0.02 2.42±0.02*2.32±0.01#2.34±0.01*#△2.35±0.01*#△2.36±0.01*#△▽LYM/（×109·L-1）1.39±0.01 1.62±0.02*1.40±0.02#1.42±0.01*#△1.43±0.01*#△1.44±0.01*#△▽NEU/（×109·L-1）0.80±0.02 0.60±0.02*0.80±0.01#0.79±0.01#0.76±0.02#*△0.71±0.03#*△▽MON/（×109·L-1）0.04±0.01 0.06±0.01*0.04±0.01#0.04±0.01*#0.05±0.01*#△0.05±0.01*#△

3.3.2 各組小鼠肺指數比較 與正常組相比，模型組肺指數升高（P＜0.05），說明造模成功。與模型組相比，利巴韋林組、高劑量組、中劑量組、低劑量組肺指數下降（P＜0.05）；與利巴韋林組相比，高劑量組、中劑量組、低劑量組肺指數升高（P＜0.05）；與高劑量組相比，中劑量組、低劑量組肺指數升高（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組小鼠肺指數的結果（±s，n=10)

表3 各組小鼠肺指數的結果（±s，n=10)

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與利巴韋林組相比，△P＜0.05；與高劑量組相比，▽P＜0.05。

組別正常組模型組利巴韋林組高劑量組中劑量組低劑量組肺指數/%0.66±0.03 1.37±0.02*0.86±0.02*#0.89±0.02*#△1.07±0.04*#△▽1.14±0.02*#△▽

3.3.3 各組小鼠感染RSV 后肺組織的病理變化 正常組肺泡腔大小正常，泡壁完整、未見明顯炎性細胞浸潤，管腔無分泌物；模型組小鼠肺組織增生，間質內出現大量炎性細胞且分布均勻，支氣管上皮增生、脫落，支氣管周圍慢性炎性細胞浸潤，肺動脈上皮增生顯著；利巴韋林組小鼠個別支氣管上皮輕度增生，肺泡大致正常；高劑量組小鼠個別支氣管上皮輕度增生、脫落，肺泡間質輕度增生；中劑量組小鼠支氣管周圍輕度慢性炎性細胞浸潤，部分上皮組織增生，間質部分肺泡充血；低劑量組小鼠肺泡壁增厚，支氣管上皮細胞增生，脫落至管腔，間質細胞增生，肺泡腔可見充血，慢性炎性細胞浸潤較明顯。 詳見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織HE 染色結果圖（×200）

3.3.4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK表達比較 與正常組相比，模型組的TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 平均光密度值升高（P＜0.05），肺組織出現大量陽性細胞染色；與模型組相比，利巴韋林組、高劑量組TLR4、NF-κB p65 及p38 MAPK 平均光密度值下降（P＜0.05），中劑量組TLR4、p38 MAPK平均光密度值下降（P＜0.05）；與利巴韋林組相比，中劑量組、低劑量組NF-κB p65 平均光密度值升高（P＜0.05）；與高劑量組相比，中劑量組、低劑量組NF-κB p65 平均光密度值升高（P＜0.05）。詳見表4，圖5-7。

圖5 各組小鼠肺組織TLR4 的免疫組化染色圖（×200）

表4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 的平均光密度值比較（±s，n=18)

表4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、p38 MAPK 的平均光密度值比較（±s，n=18)

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與利巴韋林組相比，△P＜0.05；與高劑量組相比，▽P＜0.05。

組別正常組模型組利巴韋林組高劑量組中劑量組低劑量組NF-κB p65 0.060±0.011 0.073±0.014*0.062±0.008#0.064±0.007#0.071±0.016*△▽0.072±0.010*△▽TLR4 0.056±0.004 0.062±0.006*0.056±0.004#0.055±0.004#0.057±0.007#0.058±0.010 p38 MAPK 0.052±0.006 0.116±0.184*0.049±0.004#0.048±0.004#0.055±0.013#0.067±0.009

4 討論

連翹是臨床常用清熱解毒藥，目前研究較為充分的是連翹的不同化學成分抗病毒活性，但其抗病毒機制的研究卻相對缺乏。本研究利用網絡藥理學的方法對連翹抗RSV 的活性成分、作用靶點、相關通路等進行了探討，篩選出槲皮素、連翹苷、木犀草素等21 個活性成分，129 個抗RSV 靶點，富集548個生物過程及112 條信號通路。結果表明連翹多成分協同影響宿主自身IL-1B、IL-2、IL-6 等細胞因子水平，干預HIF-1、TNF 等信號通路，從而發揮抗RSV作用[24-25]。 借助網絡藥理學的方法證實連翹通過多成分、多靶點、多通路發揮抗RSV 作用，但其方法預測藥效機制有局限性。此外，本研究通過體外細胞實驗和體內動物實驗驗證了其抗RSV 的活性。

圖6 各組小鼠肺組織NF-κB p65 的免疫組化染色圖（×200）

圖7 各組小鼠肺組織p38 MAPK 的免疫組化染色圖（×200）

在體外細胞水平上進行連翹抗RSV 作用的驗證，用預防給藥的方法證明連翹不同提取液對RSV病毒有殺滅作用。 但其不同方法的提取液抗RSV 的效果差異較大，提示煎煮液經離心或過濾后，毒性雜質減少，活性成分的組成及含量增加。

體內實驗從血常規、肺指數檢測、HE 染色方面研究連翹煎煮離心液對RSV 感染后的小鼠的影響，證實中劑量組、高劑量組對RSV 引起的肺炎具有較好的調節作用。 TLR4 是與RSV 感染的密切受體之一，可通過識別病毒的F 蛋白和細胞表面脂多糖，激活下游的p38 MAPK 和NF-κB[26-27]。 干預調控TLR4，可使得下游NF-κB p65 引發的炎性因子表達受阻，緩解RSV 引起的肺部病理損傷。 免疫組化結果推測連翹煎煮離心液可通過調動宿主免疫系統的功能，產生大量的免疫因子來阻止病毒的復制、繁殖，達到抗病毒的效果。 RSV 感染者外周血T 淋巴細胞亞群及Th1、Th2 細胞因子呈現異常表達[28]，課題組可進一步研究連翹高劑量給藥能否恢復RSV肺炎小鼠體內CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10 水平，從而發揮抗RSV 作用。