銅死亡與銅代謝相關疾病研究進展

劉駿達，鐘薇薇，魯顯福，李元海

(1. 安徽醫科大學第一附屬醫院高新院區麻醉科，安徽 合肥 230088；2. 安徽醫科大學第一附屬醫院麻醉科，安徽 合肥 230022)

銅是一種常見的金屬元素，也是一種過渡元素，具有氧化還原活性。在常規的化學反應和生理條件下，還原型Cu+可轉變為氧化型Cu2+[1]。銅離子通過提供或接受電子參與多種生化反應[2]。銅離子可與多種蛋白質或酶結合，作為輔因子或結構組成部分，參與調控能量代謝、線粒體呼吸和抗氧化等多個生理過程。銅離子的含量維持動態平衡，失衡可導致氧化應激[3]和細胞自噬異常[4]等，從而誘發多種銅或銅離子相關性疾病的發生。

2022年3月17日，Tsvetkov等[5]首次提出一種具有銅依賴性的、全新的細胞死亡方式——“銅死亡(cuprotosis)”，其不同于其他已知的細胞死亡方式，如細胞凋亡、焦亡(pyroptosis)和壞死性凋亡(necroptosis)，而類似于鋅死亡和鐵死亡，是一種金屬離子誘導的調節性細胞死亡。類似鐵死亡[6]，Cu2+通過直接與三羧酸循環中脂酰化部分相結合，誘導脂酰化蛋白的聚集和鐵-硫簇蛋白的不穩定，導致蛋白毒性應激，從而誘發不依賴于細胞凋亡途徑的細胞死亡。本文針對銅死亡的發現及銅相關疾病作一綜述。

1 銅代謝的基本過程

正常人體內含銅100～200 mg，50%～70%存在于肌肉及骨骼，20%存在于肝臟，5%～10%分布于血液[7]。人體所需銅主要通過飲食獲取，如紅肉、牛奶與堅果等。膳食中的銅主要以Cu2+形式存在，但無法被細胞直接利用。經典理論認為，消化道上皮細胞表面存在多種還原酶，可將Cu2+還原為Cu+，然后與銅轉運蛋白1(copper transporter 1，CTR1)結合進入腸上皮細胞[7]。Cu+經小腸上皮細胞吸收后由銅轉運ATP 酶α(copper-transporting ATPase alpha，ATP7A)釋放至門靜脈循環中。大部分新吸收的Cu+再經CTR1介導進入肝細胞，其中絕大部分的Cu+通過銅伴侶蛋白抗氧化物-1(antioxidant 1，Atox1)-銅轉運ATP 酶β(copper-transporting ATPase beta，ATP7B)-高爾基復合體途徑與α2-球蛋白(即前銅藍蛋白)結合形成銅藍蛋白，轉運至全身各系統。肝細胞內過量的銅經ATP7B以囊泡形式分泌至膽汁中，絕大部分以糞便的形式排出體外，小部分經過消化道再次重吸收[8]。當外周銅濃度下降，ATP7A可以將銅從肝臟儲存中調動至血液中，維持外周循環有效的銅濃度。

銅離子的吸收、轉運、儲存和排泄過程共同決定了銅代謝穩態的調節過程，銅離子含量的過量和缺乏均可導致各種疾病的發生。

2 銅死亡的發現及機制

盡管“銅死亡”的命名于2022年首次提出，但銅死亡的相關研究最初始于2019年。來自MIT和Harvard大學Broad研究所的Todd Golub團隊發現了兩種可以攜帶銅離子穿過細胞膜的小分子：雙硫侖(disulfiram)和伊利司莫(elesclomol)，經證實這兩種Cu2+載體可以殺死特定的耐藥癌細胞[9]。

雙硫侖又名戒酒硫，是一種酒精戒斷藥物，已經在臨床中用于治療酒精成癮長達60年。雙硫侖的抗腫瘤作用需要Cu2+參與，其在體內的代謝產物二硫代氨基甲酸二乙酯(diethyldithiocarbamate, DTC)與Cu2+形成螯合物——二乙基二硫代氨基甲酸銅[copper(Ⅱ) diethyldithiocarbamate, CuET]。CuET促進核蛋白定位蛋白4(nuclear protein localization protein 4, NPL4)凝結并與p97蛋白緊密結合，影響腫瘤細胞內p97蛋白發揮降解蛋白質的功能，致使大量廢棄蛋白在細胞內過度積累，最終導致腫瘤細胞死亡[10]。

伊利司莫由Synta Pharmaceuticals Corp公司研發，既往稱作STA-4783，最早于2003年由Berkenblit等在歐洲癌癥研究與治療組織(EORTC)、美國國家癌癥研究所(NCI)和美國癌癥研究協會(AACR)聯合舉辦的分子靶標與癌癥治療學國際會議上報道[11]。隨后多個研究團隊開展了一系列針對伊利司莫抗腫瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗研究，如轉移性黑色素瘤和軟骨肉瘤[12-13]。既往研究發現[14]，伊利司莫可以誘導細胞活性氧的生成、應激蛋白如熱休克蛋白70(HSP70)的表達以及線粒體心磷脂的氧化，繼而激活細胞色素C依賴的線粒體凋亡通路導致細胞死亡；另外，研究認為其抗腫瘤性也是通過調節氧化應激來實現的。然而，伊利司莫并未靶向線粒體并阻斷呼吸鏈的電子轉移[15]，那么其到底通過何種途徑產生活性氧呢？Wu等[16]采用液相色譜—質譜分析和單晶X射線衍射技術發現，伊利司莫與Cu2+可以按照1 ∶1(mol∶mol)的方式形成螯合物，且相較于Ni2+或者Fe2+，伊利司莫更容易與Cu2+形成穩定螯合物。隨后研究發現，伊利司莫會優先結合細胞外Cu2+并以伊利司莫-Cu2+復合物形式，選擇性地將Cu2+轉運至腫瘤細胞的線粒體中[17]。當細胞外Cu2+缺乏時，伊利司莫則會失去其細胞毒性。當用不具備細胞膜滲透性的銅螯合劑浴銅靈螯合細胞外Cu2+后，伊利司莫對Cu2+的攝取和細胞毒性均被阻斷[17]。伊利司莫-Cu2+復合物進入線粒體后，Cu2+被還原為Cu+，隨即產生活性氧。伊利司莫-Cu2+復合物解離后，伊利司莫從細胞內流出至胞外，并重復形成新的伊利司莫-Cu2+復合物，將Cu2+從細胞外轉運至細胞內，導致線粒體內銅的持續積累，最終誘導細胞凋亡[18]。值得注意的是，伊利司莫所表現出的線粒體選擇性是該化合物一個獨特特征，其他銅離子螯合劑(包括雙硫侖)則不具有該特征[18]。

一項Ⅲ期臨床研究的結果顯示[19]，在與紫杉醇聯合應用治療未加選擇的晚期黑色素瘤患者時，伊利司莫并未誘導顯著的臨床反應。但如果依據黑色素瘤患者的血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平對患者進行分組，相比高水平LDH患者，LDH水平較低或正常的患者在聯合伊利司莫的方案中收獲了較好的臨床效果。LDH水平與腫瘤氧供需水平有關，高水平LDH意味著腫瘤細胞處于缺氧狀態[20]，由此提示伊利司莫靶向代謝活躍的線粒體并在氧合良好的細胞中發揮作用，也提示其可能依賴于氧化磷酸化而不是糖酵解過程而發揮抗腫瘤活性。相似的結果也在離體細胞實驗中得到證實[21]。

Golub團隊對比了生理和缺氧狀態下的細胞對伊利司莫誘導的細胞毒性的敏感性差異，結果同樣發現，在缺氧條件下生長的細胞對伊利司莫誘導的細胞死亡敏感性較低[5]；同時研究結果還顯示，伊利司莫在依賴線粒體呼吸的細胞中所產生的細胞毒性較其在依賴糖酵解的細胞中所產生的細胞毒性強近1 000倍，進一步強調了細胞呼吸在介導銅誘導的細胞死亡過程中發揮的作用。此外，Soma等[22]證實，伊利司莫可以通過增加線粒體內Cu2+含量和恢復細胞色素C氧化酶活性而挽救酵母細胞的呼吸缺陷；細胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈的末端酶，銅是其重要輔助因子。另一項研究指出[23]，在結腸癌細胞中，伊利司莫和銅聯合處理導致銅滯留在線粒體內，引發活性氧累積，進而導致溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11，SLC7A11)降解，而SLC7A11與鐵死亡密切相關，且應用鐵死亡抑制劑可以減輕伊利司莫誘導的細胞死亡。由此推測，銅誘導的細胞死亡可能是一種銅依賴的鐵死亡方式。然而隨后研究發現，與鐵死亡抑制劑相比，線粒體抗氧化劑、脂肪酸或線粒體功能抑制劑更大程度地抑制了伊利司莫誘導的細胞死亡[5]；同時，代謝組學分析結果顯示，隨著伊利司莫作用時間延長，非小細胞肺癌ABC1細胞所產生的三羧酸循環代謝產物明顯增多[5]；由此表明，Cu2+誘導的細胞死亡靶向的位置可能是三羧酸循環過程本身，而不是電子傳遞鏈過程，同樣也并不是直接誘導鐵死亡過程[5]。

全基因組CRISPR-Cas9功能缺失篩選確定了介導銅死亡的特定代謝途徑。研究者采用了伊利司莫和DTC兩種銅離子載體分別處理人卵巢癌細胞，從兩者共同區間內確定10種可能與銅死亡相關的基因，其中包含7個正調控基因：鐵氧還蛋白1(ferredoxin 1,FDX1)、硫辛酸合成酶(lipoic acid synthetase, LIAS)、脂酰轉移酶1(lipoyltransferase, LIPT1)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase, DLD)、二氫硫辛酰轉乙酰基酶(dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT)、丙酮酸脫氫酶E1-α亞基(pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit, PDHA1)、丙酮酸脫氫酶E1-β亞基(pyruvate dehydrogenase E1 beta subunit, PDHB)，以及3個負調控基因：金屬調節轉錄因子1(metal regulatory transcription factor 1, MTF1)、谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A)。既往研究已證實伊利司莫可以直接靶標FDX1基因，而FDX1編碼一種還原酶，可將Cu2+還原成毒性更強的Cu+[9]。Zhang等[24]發現FDX1與ATP產生相關，并證實FDX1與葡萄糖代謝、脂肪酸氧化和氨基酸代謝密切相關[24]。與FDX1發揮的作用相類似，LIAS、LIPT1和DLD也參與了蛋白質脂酰化代謝的過程，而DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS以及CDKN2A則與丙酮酸脫氫酶復合體的形成有關[5]。

由此確定，FDX1基因和蛋白質脂酰化過程在銅誘導細胞死亡中的關鍵調控作用。蛋白質脂酰化修飾是一種從細菌到哺乳動物均高度保守的賴氨酸翻譯后修飾[25]。通過單個基因敲除研究進一步證實，FDX1和LIAS缺失致細胞產生針對銅誘導的細胞死亡的抵抗力，并通過數據庫分析確認FDX1基因與蛋白質脂酰化間存在直接聯系[5]。Cu2+與脂酰化的蛋白結合，導致DLAT脂酰化發生寡聚化，進而導致鐵-硫簇蛋白的表達減少及鐵-硫簇裝配異常。鐵-硫簇蛋白質在生命活動中發揮重要的功能, 包括電子鏈的傳遞、基因組穩定性的維持及基因表達的調控等[26]。

綜上，銅死亡的機制可以簡要表述為銅離子(包括Cu2+和Cu+)與線粒體呼吸過程中的三羧酸循環中的脂酰化成分直接結合，導致脂酰化蛋白質聚集，繼而鐵-硫簇蛋白表達下調，從而誘導蛋白質毒性應激并最終導致細胞死亡(圖1)[5]。

FDX1：鐵氧還蛋白1；TCA cycle：三羧酸循環；DLAT：二氫硫辛酰轉乙酰基酶

3 銅代謝相關疾病

銅在機體內的含量維持相對穩定，含量過低會破壞重要的金屬結合酶功能，而過高則會導致細胞功能異常，引起細胞死亡[27]。機體內銅的攝入、排出以及代謝由多種因素共同調控并維持動態平衡，當體內銅穩態被打破，銅代謝異常或銅誘導的細胞死亡會導致一系列疾病的發生。

3.1 威爾遜病

威爾遜病(Wilson′s disease)于1912年被首次定義，是最經典的銅代謝異常疾病之一。根據銅在體內不同組織的蓄積，威爾遜病可表現為肝臟和神經功能障礙，包括肌張力障礙和帕金森病[28]。威爾遜病的致病基因定位于13q14.3，ATP7B基因的異常導致銅-ATP 酶功能受損、肝臟的銅解毒功能受損和體內銅超載[29]，且ATP7B不同突變亞型導致了疾病的臨床表現多樣性[30]。Collins等[31]研究顯示，針對ATP7B基因肽的直接檢測越來越多地用于威爾遜病的臨床診斷。此外，威爾遜病患者血清中銅同位素比率(65Cu/63Cu)變化也與健康人群不同，可作為評判疾病進展的指標，并且可以用來預測患者的預后情況[32]。威爾遜病的治療可通過低銅飲食、螯合療法或在極端情況下通過肝移植來實現，直接作用于肝細胞內的Cu+螯合劑或將成為威爾遜病的治療方案[33]。在威爾遜病患者的驅銅治療過程中，偶有銅缺乏情況的發生。據研究報道，威爾遜病患者銅缺乏時出現嚴重的周圍神經損害及顯著的中性粒細胞減少，而這些癥狀在血清銅水平恢復正常后得以改善，提示銅治療方案也需要定期監測并維持銅平衡[34]。

3.2 Menkes病

Menkes病是一種罕見的X染色體隱性疾病，絕大多數患兒為男嬰，但由于X染色體的隨機失活，也有一些罕見女嬰病例的報道[35]。既往報道Menkes發病率為1/298 000[36]，但一項基于基因組聚合數據庫估算的Menkes病發病率達1/ 8 664[37]。Menkes病的致病基因定位于Xq21.1，由ATP7A突變引起，與ATP7B導致銅蓄積相反，ATP7A突變導致的臨床癥狀主要與銅缺乏相關[38]。CTR1可與ATP7A協同作用，調節細胞內銅離子水平和銅定向轉運，例如，腸上皮細胞內層和脈絡叢中，CTR1介導Cu+進入細胞內，而ATP7A促進銅從細胞中排出。Guthrie等[39]在動物實驗中證實，基于伊利司莫-Cu2+復合物選擇性釋放線粒體Cu2+的機制，伊利司莫糾正了CTR1和ATP7A有缺陷的細胞膜銅離子轉運能力，進而改善了Menkes小鼠的癥狀。

3.3 神經退行性疾病

在神經系統中，銅參與髓鞘形成，調節突觸活動和信號級聯反應以及調控神經元死亡。腦是僅次于肝臟的第二大含銅器官，在CTR1與 ATP7A轉運下，銅離子可以透過血腦屏障分布至不同腦區。銅穩態失調已經在幾種神經退行性疾病中得到證實，包括阿爾茨海默病(Alzheirmer′s disease, AD)[40]和帕金森病[41]。近來研究認為，血清中較高的游離銅水平與AD患者認知功能的衰退相關，其基本病理機制為銅離子過載引起β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)沉積與Tau蛋白異常折疊[42]。有研究表示，Cu2+不僅促進Aβ無定形聚集體的形成，還可增強對神經元的毒性，當其與Aβ結合后對神經元的毒性明顯高于Aβ[43-44]。給予AD模型小鼠飲用水中添加銅可逆轉低銅水平導致的Aβ產生和神經炎癥的發生[45]。有研究證實，帕金森病患者血清和黑質中銅水平均較低[46]。α-突觸核蛋白異常是帕金森病重要的病理特征，Cu2+、Cu+均可與其結合，而體外實驗證實通過調控CTR1水平可以抑制 α-突觸核蛋白折疊聚集，減輕帕金森病的病理改變[47]。此外，血清銅藍蛋白水平降低可特征性地加重黑質鐵沉積[48]，而Ayton等[49]研究則顯示，通過靜脈注射銅藍蛋白可能對帕金森病具有治療有一定效果。

3.4 肥胖癥

銅是脂肪分解的內源性調節器，其調控cAMP依賴的脂解作用以維持體重和能量儲存的過程[50]。銅代謝異常可導致能量代謝紊亂，而銅依賴性酶的活性和豐度變化可能與肥胖癥有關。研究發現，肝細胞中缺乏銅轉運蛋白 ATP7B 的小鼠，其肝臟中出現銅積累并誘發肝臟脂肪變性和肥胖[51]。另有研究發現，ob/ob(瘦素突變體)小鼠和高果糖飲食大鼠肝組織中銅水平顯著下降[52-53]。同樣，非酒精性脂肪性肝病患者也會出現肝組織中銅水平下降[54]。但是，肥胖患者血清中銅水平升高，且與BMI和瘦素呈正相關，表明銅和(或)銅藍蛋白可能與脂肪積累相關[55]。Bernier等[56]研究采用銅離子載體雙硫侖治療中年肥胖小鼠，結果顯示其體重恢復正常且代謝功能障礙逆轉。因此，糾正銅代謝紊亂有助于控制脂肪積累改善肥胖癥狀。

3.5 心血管疾病

既往研究指出，體內銅水平異常可能會誘發一系列心臟疾病，如缺血性心臟病[57]、心律失常[58]、心臟肥大[59]等，其機制可能是由于血清銅水平較低導致機體血脂代謝異常。最近研究發現，較高血清銅通過影響脂質代謝、低密度脂蛋白氧化及炎癥反應加速動脈粥樣斑塊的形成，從而增加動脈粥樣硬化性心臟病風險[60]。Cu2+可以通過氧化應激增加谷胱甘肽氧化，降低谷胱甘肽共軛程度，導致體內兒茶酚胺氧化繼而對心臟產生毒性[61]。Li等[62]在動物實驗中運用代謝組學分析，證實經銅暴露后豬心肌細胞中代謝物水平發生變化，其中7種上調，37種下調，其代謝物改變主要參與甘油磷脂代謝、脂肪酸的延伸與降解等過程，這些因素均與細胞自噬有關。研究顯示，ATP7A在主動脈平滑肌細胞、主動脈內皮細胞中呈高表達，當ATP7A表達下調或功能障礙時則會通過上調 miR-125b促進主動脈瘤形成，miR-125b以銅依賴性方式增強促炎信號傳導[63]。由此提示，血壓調節、主動脈炎癥或血管瘤可能與體內銅代謝及銅穩態有關。

3.6 腫瘤

多個研究證實銅代謝與腫瘤發生相關，與正常細胞相比，癌細胞對銅需求更高[64-67]；部分癌癥中表達大量脂酰化的線粒體蛋白，并表現出高強度的呼吸作用。多種癌癥類型表現出瘤組織中銅金屬含量的增高和(或)全身銅分布改變，包括乳腺癌[65]、宮頸癌[67]。值得注意的是，并不是所有腫瘤組織中銅離子水平均表現為異常升高，例如血液系統惡性腫瘤患者緩解期血清銅離子水平則較健康人明顯降低[68]。Wang等[69]研究發現，阻斷Cu2+運輸，可引起細胞氧化應激并致細胞ATP水平降低，繼而激活AMP活化蛋白激酶，從而導致脂肪生成減少，抑制腫瘤細胞的增殖。研究證實，銅與缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)表達水平密切相關[70-71]。HIF-1α可刺激血管生成，新生血管又可誘導血管內皮生長因子產生，繼而導致腫瘤血管快速生成[72]。細胞運動介質1(mediator of ErbB2-driven cell motility 1, MEMO1)是一種銅依賴性氧化還原酶，進化相對保守，對細胞運動起重要作用。MacDonald等[73]研究發現，MEMO1是一種細胞內銅依賴性蛋白，其為體外乳腺癌細胞遷移、侵襲以及體內乳腺癌細胞自發性肺轉移所必需。采用銅螯合劑四硫代鉬酸鹽可明顯減少體內Cu2+含量，降低MEMO1表達，并顯著減緩腫瘤的血管生成，抑制腫瘤生長，且對乳腺癌細胞侵襲能力有明顯的影響[73]。Safi等[74]研究發現，在激素敏感和去勢抵抗疾病模型中，雙硫侖單獨應用對前列腺癌細胞的生長無顯著影響，而雙硫侖與銅合用則明顯地抑制前列腺癌細胞生長，其機制可能與前列腺癌細胞中強烈的CTR1依賴性銅攝取有關。在胃癌中也有類似發現，Wang等[75]采用雙硫侖螯合Cu2+，通過Wnt/β-catenin通路調節應激，可抑制胃癌細胞生長。

3.7 新型冠狀病毒肺炎

銅離子水平在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者預后預測中具有一定價值。最近對武漢COVID-19患者全血微量元素的分析表明，病情較重患者血清銅含量普遍增加[76]。COVID-19患者疾病早期血清中Cu2+水平增高和Zn2+水平下降，且主要與炎癥反應有關[77]。Hackler等[78]研究發現，COVID-19患者血清銅和硒水平有助于預測患者預后，在診斷為缺銅或缺硒的患者中補充含銅佐劑可能對疾病轉歸產生積極影響。另有研究指出，未能尋找到充分證據表明補充鋅或銅可以預防COVID-19感染或成為重癥病例[79- 80]。但是，仍有學者建議將銅作為佐劑或者采用納米銅載體可能有助于COVID-19患者治療[81-82]。

4 結語

綜上所述，機體內的銅穩態通過調節銅的吸收、轉運和排出來維持。研究發現，越來越多的疾病與銅代謝紊亂相關，特別是在腫瘤領域。銅死亡是一種新的細胞調節性死亡方式，其主要與三羧酸循環代謝紊亂有關；這種死亡方式與其他調節性死亡方式之間并不完全獨立，其中可能存在緊密聯系。銅死亡的發現有助于更深入地了解銅代謝疾病及其潛在分子機制，對于完善銅代謝及銅死亡機制探討，篩選治療銅代謝疾病的相關藥物具有一定價值。