mi RNA-221沉默對腦膠質瘤U251細胞增殖與凋亡的影響

俞方毅，寧波，葉勁超，梁一鳴，陳家祥，許智蕾

（廣州市紅十字會醫院 神經外科，廣東 廣州 510220）

腦膠質瘤是最常見的成人中樞神經系統原發性惡性腫瘤，目前研究［1］表明大量miRNA與腦膠質瘤發生發展密切相關，而miRNA－221在多種腫瘤的發生中起關鍵作用，被認為是腫瘤相關的關鍵miRNA之一。本研究通過檢測miRNA－221在腦膠質瘤中的表達水平及通過沉默miRNA－221，探討其對腦膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響，為腦膠質瘤的診治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年至2019年術后病理證實為腦膠質瘤和瘤周組織35例手術標本。其中男性19例，女性16例，年齡（54.13±5.78）歲。

1.2 qRT-PC檢測Trizol法提取組織細胞RNA。miRNA－221基因引物上游下游分別為：5＇－AAAAAAAAAAGCCCGCAGC TA CATTGTCTGCTG－3＇，5＇－AAAAAAAAAAG T GCAGGGTCCGAGGT－3＇。內參GAPDH引物上游下游分別為：5＇－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3＇；5＇－CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA－3＇。檢測腦膠質瘤組織和瘤旁組織的miRNA－221表達水平。

1.3 細胞克隆形成、凋亡、周期檢測構建miRNA－221沉默的腦膠質瘤U251細胞，miRNA－221干擾效率采用qRT－PCR檢測，兩組細胞分別采用培養板以實驗組設3個復孔為基礎，接種細胞經培養、換液、洗滌、固定后進行克隆計數、流式細胞儀檢測。

1.4 統計學方法采用SPSS 25.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差表示，采用Student＇s t檢驗。所有分析均為雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR NA-221在腦膠質瘤組織和瘤旁組織的表達qRT－PCR檢測35例腦膠質瘤組織及相應瘤旁組織顯示，miR NA－221在腦膠質瘤組織的表達水平高于瘤周組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 腦膠質瘤組織和瘤旁組織中的miRNA-221表達水平

2.2 miRNA-221的干擾效率白色熒光和熒光顯微鏡下U251－miRNA－221組和U251－miRNA－221沉默組的慢病毒感染效率均高于80%，且兩組細胞生長良好，未見明顯細胞毒性作用，提示慢病毒感染效果良好。qRT－PCR檢測結果顯示，U251－miRNA－221沉默組中miRNA－221表達水平僅為U251－miRNA－221組的29.13%，明顯低于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示miRNA－221沉默的腦膠質瘤U251細胞系構建成功，可用于下一步細胞功能學實驗。

2.3 miRNA-221沉默對腦膠質瘤U251細胞增殖能力的影響細胞克隆形成實驗顯示，慢病毒感染后，U251－miRNA－221沉默組的腦膠質瘤U251細胞形成的克隆數量明顯少于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示沉默miRNA－221可抑制腦膠質瘤U251細胞增殖。見圖2。

圖2 細胞克隆形成實驗結果

2.4 miRNA-221沉默對腦膠質瘤U251細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測結果顯示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默組的細胞凋亡率高于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示miRNA－221沉默可促進腦膠質瘤U251細胞凋亡。見圖3。

圖3 細胞凋亡檢測結果

2.5 miRNA-221沉默對腦膠質瘤U251細胞周期的影響流式細胞檢測顯示，miRNA－221沉默后，兩組細胞的G1、S和G2／M期細胞比例比較無明顯差異（P＞0.05），提示miRNA－221沉默對腦膠質瘤U251細胞周期無明顯影響。

3 討論

腦膠質瘤為顱內常見腫瘤，發病機制不明，與等位基因雜合缺失、遺傳性變異、細胞信號通路異常、功能性紊亂及DNA損傷修復干細胞等相關［2］。本研究以慢病毒介導的小干擾RNA沉默人腦膠質瘤U251細胞miRNA－221的表達，觀察miRNA－221對腦膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響。本研究采用qRT－PC技術分別檢測miRNA－221在腦膠質瘤組織和瘤旁組織的表達，結果顯示miRNA－221在人腦膠質瘤組織中的表達水平高于瘤旁組織；熒光顯微鏡下U251細胞的熒光染色情況顯示，兩組慢病毒感染效率均高于80%，提示慢病毒感染效果良好；qRT－PCR檢測結果也顯示，miRNA－221沉默后miRNA－221表達水平明顯下降，提示miRNA－221沉默的腦膠質瘤U251細胞系構建成功。本研究采用細胞克隆形成實驗檢測U251細胞增殖情況，結果顯示miR－221沉默可抑制腦膠質瘤U251細胞的增殖。范崇桂等［3］在腦膠質瘤細胞中采用抑制劑沉默miRNA－221表達，結果顯示腦膠質瘤細胞的增殖能力顯著下降，提示miRNA－221確實可在體外調控腦膠質瘤細胞生長，其機制可能與靶向激活蛋白APAF1相關。本研究流式細胞儀檢測顯示，miRNA－221沉默后兩組腦膠質瘤U251細胞G1、S和G2／M期細胞比例未見明顯差異，提示miRNA－221沉默對細胞周期無明顯影響。而張春智等［4］的研究表明，miRNA－221／222抑制劑同時敲低miRNA－221和miRNA－222的表達可誘導腦膠質瘤U251細胞G1期阻滯。本研究流式細胞儀檢測結果顯示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默組的細胞凋亡率高于U251－miRNA－221組，提示miRNA－221沉默可促進腦膠質瘤U251細胞系凋亡。范崇桂等［3］的體外實驗也得到了同樣結果，并通過生物信息學技術進一步確定了凋亡蛋白酶活化因子1是miRNA－221的靶基因。miRNA的一些異常表達，如miRNA－221等也被證實對癌基因及抑癌基因有調控作用［5］。基于本實驗結果可推測，miRNA－221沉默可誘導腦膠質瘤U251細胞凋亡，進而抑制細胞增殖。有研究［6］顯示在脊髓膠質母細胞瘤中亦有相同結果，但單純沉默miRNA－221是否也可抑制U251細胞侵襲尚需進一步研究。

綜上所述，miRNA－221基因在人腦膠質瘤組織呈高表達，而慢病毒介導小干擾RNA沉默miRNA－221可明顯抑制腦膠質瘤U251細胞系的生長增殖并促進其凋亡，提示miRNA－221是一個潛在的腦膠質瘤治療靶點。