IL-6、STAT3在糖尿病視網膜病變大鼠中的表達及曲克蘆丁水溶液治療對其水平的影響

楊馥宇，劉 輝，蘇 杰，王 玲，王林洪

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy， DR)發病率為24%～70%，普遍認為其發生與氧化應激、免疫/炎癥、基因多態性等理論有關，隨著研究不斷深入，部分學者指出免疫/炎癥理論在DR發生發展中起著重要作用[1-2]。白細胞介素-6(IL-6)為多效性細胞因子，動物實驗及體外實驗均已證實，IL-6在DR大鼠或患者外周血、視網膜組織中呈異常高表達[3-4]。而高水平IL-6可持續刺激磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)，激活小膠質細胞，分泌過量IL-6，加劇視網膜神經節細胞凋亡[5]。由此可見，調控IL-6、STAT3表達有望減輕DR患者炎癥反應，延緩病情進展。曲克蘆丁具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等諸多優勢，但從IL-6、STAT3分子層面分析其在DR大鼠中應用效果的研究較少。本研究建立DR大鼠模型，觀察IL-6、STAT3蛋白變化及曲克蘆丁水溶液的治療效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 曲克蘆丁水溶液(神威藥業集團有限公司，國藥準字H13023722)；IL-6、STAT3試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；血糖測定試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2實驗動物 健康雄性大鼠60只，購自北京華阜康公司，體質量200～220 g，飼養于25 ℃環境下，空氣流通，12 h光照維持，采用鼠全價顆粒飼料適應性喂養5 d。

1.3模型建立 將1.5 g鏈脲佐菌素溶于2% 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.6)，大鼠空腹12 h后，以50 mg/kg劑量進行腹腔穿刺，回抽針栓，無氣體、血液后注入藥物，造模3 d監測血糖變化，當空腹血糖(FPG)>16.5 mmol/L時，判定為DR模型制備成功[6]。

1.4動物分組及治療 取20只大鼠為正常組，每天給予生理鹽水100 mg/kg灌胃。建立DR模型后，隨機分為模型對照組和曲克蘆丁水溶液組，各20只。模型對照組每天給予生理鹽水100 mg/kg灌胃，曲克蘆丁水溶液組每天給予曲克蘆丁水溶液100 mg/kg灌胃。灌胃12周后剔除生理狀態差、體質量差異大及死亡大鼠，后于3組中隨機選取12只大鼠行實驗研究。

1.5標本采集 治療12周后，過量麻醉處死大鼠，取大鼠完整眼球，分離眼周圍軟組織，取出并剪開眼球，去除房水及晶狀體，充分暴露視網膜，清洗干凈后放入試管，液氮凍存。

1.6視網膜組織IL-6、STAT3測定 視網膜組織稱重后，采用冰浴研磨法制作10%組織勻漿，二辛可寧酸法檢測10%組織勻漿總蛋白濃度，樣本稀釋液稀釋，調整各樣本總蛋白濃度，采用酶聯免疫吸附試驗測定IL-6蛋白含量。采用蛋白免疫印跡法測定STAT3水平。TRIzol法提取視網膜組織總蛋白，提取的每只大鼠視網膜組織等量加入100 μl裂解液，反復過濾、離心，取30 μg樣本，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，37 ℃環境封閉2 h，加入稀釋500倍的STAT3抗體，4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖溶液沖洗后與二抗結合，孵育1 h后顯色，蛋白相對表達水平以目的蛋白條帶灰度與內參的比值表示。

1.7大鼠視網膜組織形態及視網膜神經節細胞凋亡指數 摘取大鼠眼球后，常規固定、脫水、浸蠟包埋，切片厚度4 μm，應用光鏡及透射電鏡觀察視網膜各層結構及細胞形態，記錄視網膜神經節細胞凋亡數目，應用IPP 6.0圖像分析軟件分析染色結果，計算視網膜神經節細胞凋亡指數。視網膜神經節細胞凋亡指數=凋亡細胞數量/細胞總數量×100%。

1.8血糖測定 于大鼠尾部穿刺取血，應用全自動生化分析儀測定FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

2 結果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠體形適中，精神狀態良好，毛發光澤，反應靈敏，晶狀體透明；模型對照組和曲克蘆丁水溶液組大鼠體形消瘦，精神萎靡，腹部肥大，毛發欠光澤，易脫毛，動作遲緩，晶狀體渾濁，甚至晶狀體皮質溶解，角膜邊緣新生血管生長。

2.2大鼠視網膜組織形態 光鏡下，正常組視網膜組織結構正常，各層細胞排列規則，外顆粒層感光細胞分布均勻，內顆粒層細胞結構清晰，各層纖維結構無異常；模型對照組視網膜水腫，內核層、外核層細胞間水腫，細胞排列紊亂；曲克蘆丁水溶液組視網膜厚度接近正常，外核層細胞間稍疏松，排列較整齊。透射電鏡下，正常組大鼠視網膜顯微結構無異常，模型對照組可見細胞外節內膜盤排列紊亂，含糖原顆粒沉淀，早期色素上皮細胞微絨毛脫落，內質網擴張；曲克蘆丁水溶液組可見外節內膜盤排列整齊，色素上皮細胞微絨毛排列稀疏，細胞膜內褶排列緊密。

2.3大鼠血糖測定結果 造模3 d后，曲克蘆丁水溶液組、模型對照組FPG、HbA1c高于正常組(P<0.05)，但曲克蘆丁水溶液組與模型對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療12周后，曲克蘆丁水溶液組、模型對照組FPG、HbA1c高于正常組，但低于同組造模3 d后(P<0.05)；治療12周后，曲克蘆丁水溶液組FPG、HbA1c低于模型對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血糖測定結果比較

2.4大鼠視網膜組織IL-6、STAT3水平及視網膜神經節細胞凋亡指數 曲克蘆丁水溶液組、模型對照組視網膜組織IL-6、STAT3水平及視網膜神經節細胞凋亡指數高于正常組，且曲克蘆丁水溶液組低于模型對照組(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠視網膜神經節細胞凋亡指數及視網膜組織IL-6、STAT3水平比較

3 討論

調查顯示，糖尿病病程>10年者眼底病變發病率為69%～90%，以DR尤為常見[7-8]。因此，本研究建立大鼠DR模型，造模3 d后模型對照組和曲克蘆丁水溶液組FPG水平均>16.5 mmol/L，分別給予生理鹽水、曲克蘆丁水溶液灌胃，治療12周后，曲克蘆丁水溶液組FPG、HbA1c水平均低于模型對照組，考慮與曲克蘆丁水溶液具有抗炎、抗氧化作用有關，可顯著減輕炎癥、氧化應激所致胰島素抵抗，起到控制血糖的目的，但具體機制不明。

傳統觀念認為，血-視網膜屏障破壞及微血管病變是DR早期典型特征。新近研究指出，典型視網膜微血管改變前，機體已出現視功能減退及視神經損傷，表現為色覺、對比敏感度、視網膜電圖等異常[9-10]。研究表明，1型糖尿病大鼠模型建立4周后出現神經細胞丟失與凋亡[11]。神經節對細胞損傷及神經毒性作用高度敏感，可為DR早期病變鑒別診斷提供有利依據，盡早抑制視網膜神經節細胞凋亡是控制DR病情進展關鍵環節。

研究表明，免疫炎癥是DR發病重要機制，調控免疫炎癥有望控制疾病進展，但關于免疫炎癥產生的確切分子機制尚不完全清楚[12]。IL-6/JAK2/STAT3信號通路激活可促使B細胞分化為漿細胞，刺激IL-6自分泌，形成正前饋循環，擴大炎癥反應，在糖尿病、DR等疾病中扮演重要角色[13]。IL-6主要作用為促進血管活性物質分泌、介導炎癥纖維蛋白表達。當前研究證實，高水平IL-6是DR發生的獨立危險因素[14]。長期高血糖環境下，胰島細胞可合成大量IL-6，激活一系列炎癥和免疫應答反應，產生細胞毒性作用，加重胰島素抵抗，增加DR發生的風險[15-16]。同時IL-6可結合靶細胞表面IL-6受體(sIL-6R)，形成sIL-6R/IL-6復合物，活化細胞膜表面糖蛋白130，刺激JAK2，活化受體酪氨酸激酶，結合STAT3蛋白，促進STAT3磷酸化。磷酸化的STAT3可刺激核因子-κB(NF-κB)，使其轉移至細胞核后，釋放過量炎性因子，正反饋作用于NF-κB，促進炎癥反應，加劇視網膜組織損傷[17-18]。另外缺氧條件下，STAT3高表達會啟動血管內皮生長因子轉錄，誘發基底膜增厚、微動脈瘤形成、新生血管形成等一系列病理變化，最終演變為DR[19]。因此，調控IL-6/JAK2/STAT3信號通路有望成為臨床治療DR的靶點之一。

曲克蘆丁是蘆丁衍生物，其治療DR機制為，抑制血小板聚集，阻斷血栓形成；抑制Fenton反應及脂質過氧化鏈式反應，產生明顯抗脂質過氧化作用；減少活性氧生成，抑制炎癥激活，發揮抗炎作用[20]。本研究顯示，曲克蘆丁水溶液組視網膜組織IL-6、STAT3水平及視網膜神經節細胞凋亡指數低于模型對照組。提示曲克蘆丁水溶液可通過調節IL-6/JAK2/STAT3信號通路減輕炎癥反應，阻礙視網膜神經節細胞凋亡，保護視網膜毛細血管，促進DR病情轉歸。仍需注意的是，曲克蘆丁水溶液組各指標均與正常組存在一定差異。提示曲克蘆丁水溶液治療DR大鼠效果仍存在一定局限性，建議后續通過延長曲克蘆丁水溶液治療時間、增加曲克蘆丁水溶液劑量等方面進行更深入研究。

綜上所述，DR大鼠視網膜組織IL-6、STAT3呈高表達，經曲克蘆丁水溶液治療后其水平降低，但本研究僅采取實驗性DR大鼠展開研究，建議將來通過體外研究進一步探討曲克蘆丁水溶液治療DR的作用靶點及關鍵機制。