miR-328-5p對乳腺癌細胞的調控機制研究

孫靜宜，李建梅，馬英橋，趙 月

微小RNA(miR)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA，可作為致癌基因和抑癌基因在腫瘤發生、發展中起重要調控作用，被認為是潛在的腫瘤標志物和治療靶點[1-2]。研究發現長鏈非編碼RNA或環狀RNA通過調控miR-328-5p表達參與非小細胞肺癌等多種腫瘤的發生發展，有潛力成為多種惡性腫瘤的診斷標志物[3]。多項研究表明，多個異常高活性信號通路已被證實能阻止腫瘤細胞失巢凋亡，其中異常高活化整合素在人類肝癌細胞轉移期發揮重大作用[4-5]。但關于miR-328-5p、整合素與乳腺癌發生、進展的關系及具體機制尚未明確[6]。本文分析miR-328-5p對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響，并進一步探討miR-328-5p與整合素α5(ITGA5)的關系及其調控PI3K/AKT信號通路的具體機制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細胞系MCF10A，購自美國ATCC細胞庫。胎牛血清及RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司，LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Matri-gel基質膠及細胞培養板購自美國BD公司。miR-328-5p mimic和miR-NC購自上海美軒生物科技有限公司，兔抗人ITGA5多克隆抗體購自博奧派克生物有限公司，兔抗人ITGA5單克隆抗體購自美國Abcam公司。PCR儀、化學發光儀凝膠成像系統、流式細胞儀及透射電鏡購自美國BD公司。

1.2研究方法

1.2.1細胞培養：乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細胞系MCF10A用含10%胎牛血清RPMI1640培養基培養，培養基中加入雙抗青霉素-鏈霉素，后置于37 ℃、5% CO2培養箱中恒溫培養。

1.2.2細胞轉染：取生長狀態良好的乳腺癌細胞MCF-7，據不同轉染方法分為Control組(空白對照)、miR-NC組(轉染陰性對照miR-NC)、miR-328-5p mimic組(轉染miR-328-5p mimic)及miR-328-5p mimic+ITGA5組。ITGA5按照LipofectamineTM2000說明書瞬時轉染。轉染6 h后換液，繼續培養用于后續實驗。

1.2.3miR-328-5p、ITGA5檢測：使用miRNA提取試劑盒從細胞中提取RNA，用逆轉錄試劑盒行逆轉錄和RT-PCR。計算機系統自動分析各樣本Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miRNA相對表達量。

1.2.4miR-328-5p與ITGA5的靶向關系：通過TargetScan法[7]及熒光素酶報告基因檢測觀察miR-328-5p與ITGA5的靶向關系。

1.2.5細胞增殖：采用CCK-8法[8]檢測細胞增殖能力。將處于對數生長期的MCF-7細胞鋪于96孔板中，3000個/孔行轉染培養。每組重復3次，培養48 h，加入CCK-8試劑10 μl室溫孵育4 h，酶標儀測定吸光度值。

1.2.6細胞凋亡：應用流式細胞儀[9]檢測乳腺癌MCF-7細胞凋亡情況。細胞經轉染處理后，胰酶消化收集細胞，PBS液洗滌，加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl室溫避光孵育30 min，通過流式細胞儀采用Annexin-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測MCF-7細胞凋亡情況。

1.2.7ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表達：采用Western blot法[10]檢測ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表達，根據目的蛋白和內參灰度值之比分析ITGA5、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表達。

2 結果

2.1不同乳腺癌細胞系miR-328-5p、ITGA5 mRNA比較 乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中miR-328-5p mRNA含量顯著低于正常乳腺上皮細胞系MCF10A，而ITGA5 mRNA含量顯著高于正常乳腺上皮細胞系MCF10A(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同乳腺癌系細胞miR-328-5p、ITGA5 mRNA含量比較ITGA5為整合素α5；與MCF10A細胞比較，①P<0.05

2.2miR-328-5p與ITGA5的靶向關系 miR-328-5p mimic組miR-328-5p mRNA含量顯著高于Control組和miR-NC組(P<0.05)；miR-328-5p轉染后ITGA5熒光素酶活性顯著下調(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-328-5p與ITGA5的靶向關系ITGA5為整合素α5；與Control組、miR-NC組或wt-ITGA5比較，①P<0.05

2.3不同轉染組MCF-7細胞ITGA5 mRNA含量比較 miR-328-5p、ITGA5轉染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著低于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同轉染組MCF-7細胞ITGA5 mRNA含量

2.4不同轉染組MCF-7細胞增殖情況 miR-328-5p mimic組MCF-7細胞增殖率顯著低于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)。見圖4。

2.5不同轉染組MCF-7細胞凋亡情況 miR-328-5p mimic組MCF-7細胞凋亡率顯著高于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)；與Control組比較，miR-328-5p mimic組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-328-5p mimic組比較，miR-328-5p mimic+ITGA5組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5。

圖5 不同轉染組MCF-7細胞凋亡率比較

2.6不同轉染組MCF-7細胞ITGA5蛋白及PI3K/AKT通路蛋白比較 與Control組比較，miR-NC組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，miR-328-5p mimic組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達顯著降低(P<0.05);與miR-328-5p mimic組比較，miR-328-5p mimic+ITGA5組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 不同轉染組MCF-7細胞ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達比較

3 討論

隨訪調查顯示：大多數早中期乳腺癌患者5年內預后較好，而侵襲和轉移是乳腺癌預后不良的主要因素[11-13]，但目前臨床對乳腺癌侵襲、轉移的具體分子機制尚不完全清楚[14]。研究顯示，在乳腺癌的發生及病情進展中，miR可能起著關鍵作用[15-16]。且miR參與乳腺癌發生、進展的機制可能為干擾腫瘤抑制因子和促進癌基因表達[17]。

長鏈非編碼RNA TPTEP1競爭性抑制miR-328-5p，從而抑制非小細胞肺癌細胞增殖。乳腺癌組織miR-328-5p可通過靶向糖基化終產物受體抑制MDA-MB-231細胞增殖，但具體作用機制還有待進一步研究。本研究發現，miR-328-5p在MCF-7細胞內表達最低，故以MCF-7細胞作為后續實驗對象；進一步實驗發現：miR-328-5p轉染后，miR-328-5p mimic組miR-328-5p mRNA含量顯著高于miR-NC組與Control組，而細胞增殖率與凋亡率則分別低于、高于miR-NC組、Control組，提示miR-328-5p可抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖，促進其凋亡。且miR-328-5p轉染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著降低，ITGA5熒光素酶活性顯著下調，認為miR-328-5p可靶向作用ITGA5。大部分整合素已被明確是重要的卵巢癌轉移介質，且關系最為緊密的為ITGA5[18]。大量研究顯示，整合素異常高活化在腫瘤轉移中發揮重要作用，并可介導細胞間黏附，推動腫瘤細胞遷移[19-20]。本實驗數據顯示：乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中ITGA5 mRNA含量顯著高于正常乳腺上皮細胞系MCF10A；且經miR-328-5p轉染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著降低，miR-328-5p mimic組細胞增殖率、凋亡率顯著低于、高于miR-NC組、Control組及miR-328-5p mimic+ITGA5組，提示敲除ITGA5基因可使得乳腺癌細胞增殖減少。曾有研究證實，PI3K/AKT信號通路失衡嚴重影響多種腫瘤的發生、進展及治療耐藥性，在細胞增殖、凋亡中起著至為關鍵的作用[21-22]。

AKT蛋白處于PI3K/AKT信號通路的中心位置，經磷酸化后被激活形成p-AKT，后者進一步使多個AKT下游蛋白發生磷酸化，從而調控腫瘤細胞增殖與凋亡[23-24]。劉洋等[25]分別檢測正常乳腺上皮細胞系MCF10A和乳腺癌細胞PI3K、AKT表達，發現正常乳腺組織PI3K、AKT蛋白與mRNA表達明顯高于乳腺癌細胞，推測PI3K/AKT信號通路與乳腺癌進展密切相關。本研究Western blot法檢測結果證實miR-328-5p可抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制乳腺癌細胞增殖、誘導其凋亡。

綜上，miR-328-5p可抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖，促進細胞凋亡，作用機制可能與靶向作用ITGA5下調PI3K/AKT信號通路有關。