miR-328-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究

孫靜宜，李建梅，馬英橋，趙 月

微小RNA(miR)是一類高度保守的單鏈非編碼小RNA，可作為致癌基因和抑癌基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)控作用，被認(rèn)為是潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA或環(huán)狀RNA通過(guò)調(diào)控miR-328-5p表達(dá)參與非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有潛力成為多種惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物[3]。多項(xiàng)研究表明，多個(gè)異常高活性信號(hào)通路已被證實(shí)能阻止腫瘤細(xì)胞失巢凋亡，其中異常高活化整合素在人類肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移期發(fā)揮重大作用[4-5]。但關(guān)于miR-328-5p、整合素與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)系及具體機(jī)制尚未明確[6]。本文分析miR-328-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步探討miR-328-5p與整合素α5(ITGA5)的關(guān)系及其調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Matri-gel基質(zhì)膠及細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)BD公司。miR-328-5p mimic和miR-NC購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司，兔抗人ITGA5多克隆抗體購(gòu)自博奧派克生物有限公司，兔抗人ITGA5單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。PCR儀、化學(xué)發(fā)光儀凝膠成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀及透射電鏡購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入雙抗青霉素-鏈霉素，后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，據(jù)不同轉(zhuǎn)染方法分為Control組(空白對(duì)照)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miR-NC)、miR-328-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-328-5p mimic)及miR-328-5p mimic+ITGA5組。ITGA5按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3miR-328-5p、ITGA5檢測(cè)：使用miRNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4miR-328-5p與ITGA5的靶向關(guān)系：通過(guò)TargetScan法[7]及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)觀察miR-328-5p與ITGA5的靶向關(guān)系。

1.2.5細(xì)胞增殖：采用CCK-8法[8]檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞鋪于96孔板中，3000個(gè)/孔行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μl室溫孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.2.6細(xì)胞凋亡：應(yīng)用流式細(xì)胞儀[9]檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS液洗滌，加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μl室溫避光孵育30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀采用Annexin-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)：采用Western blot法[10]檢測(cè)ITGA5及PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參灰度值之比分析ITGA5、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1不同乳腺癌細(xì)胞系miR-328-5p、ITGA5 mRNA比較 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中miR-328-5p mRNA含量顯著低于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A，而ITGA5 mRNA含量顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同乳腺癌系細(xì)胞miR-328-5p、ITGA5 mRNA含量比較ITGA5為整合素α5；與MCF10A細(xì)胞比較，①P<0.05

2.2miR-328-5p與ITGA5的靶向關(guān)系 miR-328-5p mimic組miR-328-5p mRNA含量顯著高于Control組和miR-NC組(P<0.05)；miR-328-5p轉(zhuǎn)染后ITGA5熒光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-328-5p與ITGA5的靶向關(guān)系ITGA5為整合素α5；與Control組、miR-NC組或wt-ITGA5比較，①P<0.05

2.3不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞ITGA5 mRNA含量比較 miR-328-5p、ITGA5轉(zhuǎn)染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著低于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞ITGA5 mRNA含量

2.4不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞增殖情況 miR-328-5p mimic組MCF-7細(xì)胞增殖率顯著低于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.5不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞凋亡情況 miR-328-5p mimic組MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著高于Control組、miR-NC組及miR-328-5p mimic+ITGA5組(P<0.05)；與Control組比較，miR-328-5p mimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與miR-328-5p mimic組比較，miR-328-5p mimic+ITGA5組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞凋亡率比較

2.6不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞ITGA5蛋白及PI3K/AKT通路蛋白比較 與Control組比較，miR-NC組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-328-5p mimic組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與miR-328-5p mimic組比較，miR-328-5p mimic+ITGA5組ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 不同轉(zhuǎn)染組MCF-7細(xì)胞ITGA5、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)比較

3 討論

隨訪調(diào)查顯示：大多數(shù)早中期乳腺癌患者5年內(nèi)預(yù)后較好，而侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后不良的主要因素[11-13]，但目前臨床對(duì)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚不完全清楚[14]。研究顯示，在乳腺癌的發(fā)生及病情進(jìn)展中，miR可能起著關(guān)鍵作用[15-16]。且miR參與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制可能為干擾腫瘤抑制因子和促進(jìn)癌基因表達(dá)[17]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA TPTEP1競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-328-5p，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。乳腺癌組織miR-328-5p可通過(guò)靶向糖基化終產(chǎn)物受體抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-328-5p在MCF-7細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最低，故以MCF-7細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：miR-328-5p轉(zhuǎn)染后，miR-328-5p mimic組miR-328-5p mRNA含量顯著高于miR-NC組與Control組，而細(xì)胞增殖率與凋亡率則分別低于、高于miR-NC組、Control組，提示miR-328-5p可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。且miR-328-5p轉(zhuǎn)染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著降低，ITGA5熒光素酶活性顯著下調(diào)，認(rèn)為miR-328-5p可靶向作用ITGA5。大部分整合素已被明確是重要的卵巢癌轉(zhuǎn)移介質(zhì)，且關(guān)系最為緊密的為ITGA5[18]。大量研究顯示，整合素異常高活化在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，并可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，推動(dòng)腫瘤細(xì)胞遷移[19-20]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中ITGA5 mRNA含量顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A；且經(jīng)miR-328-5p轉(zhuǎn)染后，miR-328-5p mimic組ITGA5 mRNA含量顯著降低，miR-328-5p mimic組細(xì)胞增殖率、凋亡率顯著低于、高于miR-NC組、Control組及miR-328-5p mimic+ITGA5組，提示敲除ITGA5基因可使得乳腺癌細(xì)胞增殖減少。曾有研究證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路失衡嚴(yán)重影響多種腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及治療耐藥性，在細(xì)胞增殖、凋亡中起著至為關(guān)鍵的作用[21-22]。

AKT蛋白處于PI3K/AKT信號(hào)通路的中心位置，經(jīng)磷酸化后被激活形成p-AKT，后者進(jìn)一步使多個(gè)AKT下游蛋白發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡[23-24]。劉洋等[25]分別檢測(cè)正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A和乳腺癌細(xì)胞PI3K、AKT表達(dá)，發(fā)現(xiàn)正常乳腺組織PI3K、AKT蛋白與mRNA表達(dá)明顯高于乳腺癌細(xì)胞，推測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路與乳腺癌進(jìn)展密切相關(guān)。本研究Western blot法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)miR-328-5p可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。

綜上，miR-328-5p可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制可能與靶向作用ITGA5下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。