禾谷鐮刀菌胞外多糖誘導SGC-7901細胞凋亡作用及其機制研究

王姣姣，袁平川，許寒池，陳 穎，張斯佳，田夢云，余子琪，柳春燕*

1皖南醫學院安徽省多糖藥物工程技術研究中心 皖南醫學院藥學院藥物研發中心；2活性生物大分子安徽省重點實驗室；3安徽省皖南地區植物藥活性篩選與再評價工程實驗室，蕪湖 241000

胃癌是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]，在進展期多采用化療，常見化療藥物如順鉑和5-氟尿嘧啶等，然而化療藥物的耐藥性和毒性導致患者生存率較低[2,3]。多糖作為天然高分子聚合物及其衍生物，空間結構復雜，生物活性多樣[4]。許多研究表明，多糖在防止腫瘤發生和抑制腫瘤生長中具有良好的效果[5]，其能夠通過調控腫瘤細胞中多種信號轉導途徑和癌基因的表達，從而改變細胞膜流動性，抑制腫瘤侵襲和轉移，以及誘導細胞發生凋亡和周期阻滯等[6-8]。

本課題組長期致力于從真菌發酵液中分離和發現具有抗腫瘤作用的活性多糖，在廣泛的篩選中我們發現，從蘋果鏈格孢菌發酵液中分離出的胞外多糖具有良好的抗腫瘤活性[9]，這提醒我們植物病原菌可能是抗腫瘤活性多糖的一個重要來源。禾谷鐮刀菌又名禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)，能夠侵染小麥，致使病穗上出現粉紅色或橘紅色的霉狀物，引發植物赤霉病[10,11]。本研究首次從禾谷鐮刀菌發酵液中分離得到禾谷鐮刀菌胞外多糖，經過體外篩選發現，FGEPS能夠顯著抑制人胃癌細胞SGC-7901的增殖。本文通過對禾谷鐮刀菌胞外多糖體外抗胃癌SGC-7901作用及其機制的探究，為開發抗胃癌活性多糖藥物提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與材料

1.1.1 主要儀器

LC-20AP半制備高效液相色譜儀(日本Shimadzu)；Epoch全波長酶標儀(美國BioTek)；G3000pwxl型色譜柱(日本TOSOH BIOSCIENCE)；CO2培養箱(美國SIM INTERNATIONAL GROUP)；FACSVerse流式細胞儀(美國Becton,Dickinson and Company)；BX53熒光正置顯微鏡，IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus Corporation)；WIX-miniPR02迷你垂直電泳槽，WIX-miniBLOT迷你轉印槽，WIX-EP600通用電泳儀電源(偉克斯科技有限公司)；Amersham Imager 600全自動化學發光凝膠成像分析系統(美國General Electric Company)。

1.1.2 主要試劑

RPMI 1640基礎培養基(Cat.NO.：8121075，GIBCO公司)；胎牛血清(Cat.NO.：S711-001S，LONSA SCIENCE SRL公司)；CCK-8試劑盒(Cat.NO.：C0037)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Cat.NO.：C1062M)、Hoechst 33258染色試劑盒(Cat.NO.：C0003)、JC-1(Cat.NO.：C2006)、SDS-PAGE配膠試劑盒(Cat.NO.：P0012A)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×(Cat.NO.：P0015)、BCA試劑盒(Cat.NO.：P0009)、RIPA裂解液(Cat.NO.：P0013B)購自碧云天生物科技公司；彩色預染蛋白標準品(Cat.NO.：26616，Thermo Science公司)；Bcl-2(Cat.NO.：A0208)、Bax(Cat.NO.：A7626)、Cleaved Caspase-3(Cat.NO.：A0214)、Cleaved Caspase-9(Cat.NO.：A2636)、ACTB(Cat.NO.：AC026)抗體購自ABclone Technology公司。

1.1.3 實驗細胞與菌種

人胃癌細胞SGC-7901(Cat.NO.：C6795)、BGC-823(Cat.NO.：C6123)和MGC-803(Cat.NO.：C6582)購自碧云天生物技術有限公司，已在原公司完成細胞STR鑒定；禾谷鐮刀菌菌種來自于山東省農業科學院植物保護研究所齊軍山研究員饋贈，細胞及菌種現保存于安徽省多糖藥物工程技術研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 禾谷鐮刀菌的培養和發酵

PDA培養基配制[12]：200 g馬鈴薯切碎并加水煮沸30 min，紗布過濾后加入17 g瓊脂并加熱溶解，繼續加入15 g葡萄糖后補水至1 L，分裝后高壓蒸汽滅菌。液體培養基配制[13]：葡萄糖10 g，酵母膏2 g，0.5 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.25 g CaCl2，加純水定容至1 L。300 mL錐形瓶分裝，每瓶200 mL，滅菌備用。菌種使用PDA平面培養基在28 ℃恒溫培養，并活化3～5天，在菌絲長勢良好但未產生孢子前，挑取邊緣菌絲接入液體培養基中，在28 ℃、150 r/min的條件下恒溫發酵培養7天[14,15]。

1.2.2 FGEPS的制備

發酵液過濾去除菌絲體，60 ℃減壓濃縮，加入四倍體積95%乙醇混勻，4 ℃下靜置12 h。離心保留沉淀并加入超純水在60 ℃加熱溶解，再次離心后保留上清。D101大孔樹脂脫色[16]，蒽酮硫酸法檢測并收集洗脫液，進一步使用Sevage試劑法[17](V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1，V多糖溶液∶VSevage試劑= 4∶1)對多糖溶液進行脫蛋白。0.22 μm濾膜過濾除菌后，使用再生纖維素透析袋(截留分子量3 500 Da)于4 ℃下透析72 h，收集截留液冷凍干燥得到胞外多糖FGEPS。

1.2.3 紅外和紫外光譜掃描

FGEPS使用KBr壓片，并于傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍進行掃描[18]。精密稱取FGEPS使用超純水配制成5 mg/mL溶液，使用紫外可見分光光度計在190～400 nm波長范圍進行掃描。

1.2.4 高效凝膠滲透色譜

采用高效尺寸排阻色譜法測定分析FGEPS，色譜條件：RID-10A示差折光檢測器，G3000pwxl型色譜柱(內徑×長度：7.8 mm × 30 cm，東曹株式會社)，柱溫40 ℃，流速0.7 mL/min，流動相為超純水，定量環20 μL，樣品濃度5 mg/mL。

1.2.5 細胞培養及CCK-8測定細胞增殖抑制

人胃癌細胞系SGC-7901、BGC-823和MGC-803細胞株使用1640完全培養基(含10%胎牛血清和1%雙抗的1640基礎培養基)培養，在5%的CO2、37 ℃條件下恒溫培養，細胞處于對數生長期時可用于實驗。

取對數期SGC-7901細胞，培養于96孔細胞培養板內。每孔加入100 μL細胞懸液(5×104個/mL)，培養箱中孵育12 h待細胞貼壁后，每孔分別加入100 μL含有不同濃度FGEPS的完全培養基，使其終濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL(每組設5個復孔)，繼續培養24 h。采用CCK-8試劑盒進行細胞增殖檢測。BGC-823和MGC-803細胞的培養、給藥處理及增殖抑制測定的方法同上。

式中，A對照組：不含藥物組的吸光度；A給藥組：加入各濃度FGEPS處理組的吸光度。

1.2.6 細胞形態分析

取對數期SGC-7901細胞，六孔板每孔加入1 mL細胞懸液(3×105個/mL)，吹打分散均勻。貼壁后棄去培養基并以PBS潤洗后，加入1 mL含FGEPS完全培養基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)，處理24 h后，使用倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.7 Hoechst 33258染色

取對數生長期SGC-7901細胞，調整細胞密度至1.5×105個/mL。在6孔板中放置細胞爬片蓋玻片，每片上加入細胞懸液200 μL繼續培養。細胞貼壁后在細胞密度為50%～80%時，棄去培養基并加入含FGEPS(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)完全培養基。處理24 h后，棄去培養液，加入0.5 mL固定液在4 ℃下固定12 h。棄去固定液后，PBS清洗兩遍。加入0.5 mL的Hoechst 33258染色液，染色5 min。PBS清洗兩遍，抗熒光淬滅封片液封片，使用正置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI染色

取對數生長期SGC-7901細胞，六孔板每孔加入1 mL細胞懸液(3×105個/mL)。貼壁后棄去培養基并以PBS潤洗，分別加入1 mL含FGEPS的完全培養基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)。處理24 h后消化、離心收集細胞。結合液重懸分散細胞后，各組依次加入5 μL的AnnexinV-FITC熒光探針和10 μL的PI染液，混勻后在20～25 ℃下避光孵育20 min。流式細胞儀檢測，Flowjo軟件分析。

1.2.9 JC-1染色

取對數生長期SGC-7901細胞，調整細胞密度至3×105個/mL。在6孔板中放置蓋玻片，每孔加入細胞懸液1 mL繼續培養。細胞貼壁后在細胞密度為50%～80%時，棄去培養基并加入含FGEPS完全培養基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)。處理24 h后，棄去培養液，PBS洗滌后加入1 mL胰酶消化液(不含EDTA)消化細胞，待消化結束后移除胰酶消化液，加入新的培養液，吹打后慢速離心收集細胞，0.5 mL培養液重懸后加入0.5 mL JC-1染色工作液，輕彈混勻，37 ℃孵育20 min。孵育結束后用預冷的JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次并重懸，使用流式細胞儀分析。

1.2.10 Western blot

取對數期SGC-7901細胞，培養于6孔板中。每孔加入1 mL細胞懸液(5×105個/mL)。貼壁后，棄去培養基并以PBS潤洗，分別加入1 mL含FGEPS的完全培養基(0、0.5、1.0、1.5 mg/mL)繼續培養24 h。棄去培養基冰上裂解后，4 ℃下以12 000 g離心10 min，提取細胞總蛋白。BCA法調整各組樣品蛋白濃度后，按體積比4∶1將樣品蛋白與上樣緩沖液5×混合后，煮沸變性。實驗組每孔上樣蛋白20 μg，體積10 μL，進行電泳、轉膜、封閉，一抗孵育(1∶1 000稀釋)和二抗(1∶10 000稀釋)孵育，使用化學發光顯影曝光，Image J軟件分析。

1.2.11 統計學分析

所有數據均采用均數±標準差進行統計和描述，使用SPSS 13.0軟件進行分析，多組均數的比較，使用單因素方差分析，兩組間差異采用Dunnett-t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 多糖提取及分離

如圖1所示，禾谷鐮刀菌菌種活化后長勢良好，挑取邊緣菌絲接種到共8 L液體培養基中，發酵7天后收集發酵液，經過醇沉、脫色、脫蛋白、透析和凍干后，得到禾谷鐮刀菌胞外多糖670 mg，多糖得率為83.75 mg/L。

圖1 禾谷鐮刀菌胞外多糖的制備Fig.1 Preparation of FGEPS

2.2 IR、UV光譜分析

圖2A為FGEPS的紅外光譜。3 600～3 200 cm-1處的吸收帶是-OH的伸縮振動吸收峰，此區域的吸收峰為糖類的特征吸收峰。3 377 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰，是糖類的特征峰；2 929 cm-1處的吸收峰是多糖的C-H伸縮振動；1 649 cm-1處的吸收峰為結晶水引起；1 539 cm-1處的吸收峰為C=O的伸縮振動峰；1 415 cm-1處的吸收峰是C-O的伸縮振動峰；1 030 cm-1處的吸收峰為O-H的變角振動引起。紅外光譜表明通過方法“1.2.2”制備最終得到的成分是多糖。如圖2B所示，FGEPS在260～280 nm內無紫外吸收，表明該多糖中不含有多肽及核酸類物質。

圖2 FGEPS的紅外和紫外光譜Fig.2 Infrared and ultraviolet spectra of FGEPS

2.3 HPGPC分析

脫色脫蛋白及透析處理后的禾谷鐮刀菌胞外多糖，經HPGPC分析顯示共有四個組分，結合紅外光譜表明該物質是多糖成分，紫外掃描顯示不含有多肽核酸類物質，經透析去除3 500 Da分子量以下的物質，因此該色譜圖出峰均為多糖物質引起。如圖3所示，HPGPC表明FGEPS含有四個組分。1號峰保留時間(retention time，tR)為8.207 min，峰面積占比75.99%；2號峰tR=9.637 min，峰面積占比17.86 %；3號峰tR=10.079 min，峰面積占比3.45 %、4號峰tR=10.212 min，峰面積占比2.70 %。從保留時間來看，1號峰保留時間最短，組分相對分子量最大。結合各組分含量占比分析，FGEPS發揮生物學活性的成分可能主要是1號峰所在的組分。

圖3 FGEPS的高效凝膠滲透色譜Fig.3 High performance gel permeation chromatography of FGEPS

2.4 細胞增殖

如圖4所示，使用不同濃度的FGEPS分別處理人胃癌SGC-7901、BGC-823和MGC-803細胞24 h后，相比對照組，FGEPS在濃度為0.8 mg/mL之后，能夠顯著抑制三種胃癌細胞的增殖(P< 0.05或P< 0.01)，在2 mg/mL時對SGC-7901、BGC-823和MGC-803細胞的抑制率分別為(43.86 ± 8.57)%、(36.21 ± 2.52)%和(33.45 ± 2.18)%。由圖4知FGEPS對三種人胃癌細胞的增殖均有抑制作用，而對SGC-7901細胞的抑制效果最顯著，且具有濃度依賴性，后續實驗選擇SGC-7901細胞為研究對象。

圖4 FGEPS對SGC-7901、BGC-823和MGC-803細胞增殖的影響Fig.4 Effect of FGEPS on proliferation of SGC-7901,BGC-823 注：與SGC-7901對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與BGC-823對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與MGC-803對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。Note:Compared with SGC-7901 control group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with BGC-823 control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with MGC-803 control group,△P<0.05,△△P<0.01.

2.5 細胞形態

如圖5可見，正常組細胞形態清晰，數量較多。給予FGEPS處理后，細胞均呈現皺縮、變形，細胞膜出現發泡現象，甚至出現死細胞。1.5 mg/mL的FGEPS處理組，細胞由于凋亡使得活細胞數量明顯減少，細胞嚴重收縮變形。結果表明，FGEPS可導致SGC-7901細胞收縮變形、細胞膜發泡。

2.6 Hoechst 33258染色

細胞染色質經過Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下正常細胞的細胞核為藍色，而凋亡細胞由于染色質固縮呈現致密濃染，顏色發白并較為明亮。如圖6所示，隨著給藥劑量的增加，細胞凋亡現象加重，出現較多的凋亡小體。此外在1.5 mg/mL時，細胞數量減少，細胞核明顯縮小。

2.7 Annexin V-FITC雙染

細胞凋亡早期時磷脂酰絲氨酸外翻，能夠被Annexin V-FITC結合。而壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性后的細胞核能夠被碘化丙啶(propidium iodide，PI)結合。如圖7所示，隨著FGEPS劑量的增大，SGC-7901細胞凋亡率顯著增加，對比對照組，1.0 mg/mL時凋亡率為(12.18 ± 2.16)%(P<0.01)，1.5 mg/mL時，凋亡率為(15.69 ± 0.51)%(P<0.001)。結果表明，FGEPS能夠誘導SGC-7901細胞發生凋亡，并伴有濃度依賴性。

2.8 JC-1染色

線粒體膜電位(ΔΨm)的下降是細胞凋亡的標志之一，JC-1是一種良好的熒光探針，當膜電位較高時，JC-1聚合于基質中產生紅色熒光；而當膜電位較低時，JC-1以單體形式存在，發出綠色熒光。如圖8所示，隨著FGEPS劑量的增大，SGC-7901細胞線粒體膜電位水平顯著降低，與對照組相比，1.0 mg/mL時的線粒體膜電位水平為(10.73±1.16)%(P<0.05)，給藥濃度為1.5 mg/mL時，膜電位水平為(12.1±1.83)%(P<0.01)。結果表明，FGEPS能夠顯著降低SGC-7901細胞線粒體膜電位水平，并伴有濃度依賴性。

圖5 FGEPS對SGC-7901細胞形態的影響(×200)Fig.5 Effect of FGEPS on the morphology of SGC-7901 cells

圖6 FGEPS對SGC-7901細胞染色質的影響(×400)Fig.6 Effect of FGEPS on chromatin of SGC-7901 cells

圖7 FGEPS對SGC-7901細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of FGEPS on apoptosis of SGC-7901 注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.

2.9 Western blot

如圖9所示，對比空白組，FGEPS能夠顯著上調SGC-7901細胞中促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9表達(P<0.01或P<0.001)，并下調抑凋亡蛋白Bcl-2表達(P<0.001)，表明線粒體介導的凋亡途徑在FGEPS誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡過程中發揮著重要作用。

3 討論與結論

天然產物一直是醫藥開發的寶庫，在疾病治療中發揮著巨大作用，就抗腫瘤而言，如紫杉醇、喜樹堿、鬼臼毒素、長春堿等，這些天然藥物不僅具有應用效果，同時也為新化合物的合成提供了思路和參考[19-21]。真菌發酵過程中次級代謝產物是活性多糖的重要來源，從黑根霉發酵液中分離得到的胞外多糖EPS，通過激活小鼠結腸癌CT26細胞中的AMP活化蛋白激酶(AMPK)途徑，以劑量和時間依賴性的方式抑制細胞生長并促進細胞凋亡[22]；擬康氏木霉胞外多糖以劑量依賴性方式增加Caspase-9和Caspase-3的活性，增加Bax/Bcl-2的比例，促進細胞色素C(Cyt-C)向細胞質釋放，通過固有線粒體凋亡途徑誘導MCF-7細胞凋亡[23]；蘋果鏈格孢菌胞外多糖能夠增加胃癌BGC-823細胞的活性氧水平，降低線粒體膜電位并形成凋亡小體[9]。本研究中能夠有效抑制人胃癌細胞SGC-7901增殖的FGEPS正是從禾谷鐮刀菌發酵液中分離得到，CCK-8實驗表明FGEPS能夠有效抑制人胃癌SGC-7901細胞的增殖，細胞形態學結果表明FGEPS能夠引起SGC-7901細胞收縮變形、胞膜發泡，甚至形成凋亡小體，而這些現象正是細胞凋亡的表現。AnexinV-FITC/PI雙染、Hoechst 33258染色及JC-1的染色結果表明FGEPS可誘導SGC-7901細胞發生凋亡，并可能與線粒體介導的途徑有關。由于細胞凋亡是由基因控制的細胞自身程序性死亡，涉及一系列基因的調控[24]，因此根據相關結果，我們研究了線粒體途徑在FGEPS誘導SGC-7901細胞凋亡中的作用。

圖8 FGEPS對SGC-7901細胞線粒體膜電位的影響Fig.8 Effect of FGEPS on mitochondrial membrane potential of SGC-7901 注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

圖9 FGEPS對SGC-7901細胞Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達的影響Fig.9 Effect of FGEPS on the expression of Bax,Bcl-2,Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 proteins in SGC-7901 注：與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note:Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.

通過對引起凋亡作用機制的探討，我們發現FGEPS能夠顯著上調促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達，并下調抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達，這顯示線粒體途徑介導的細胞凋亡與FGEPS發揮抗人胃癌SGC-7901作用關系密切。線粒體介導的細胞凋亡主要是指在凋亡信號的刺激下，抑凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白家族中Bax比率失衡，Bax的過表達引起線粒體膜通透性增加，釋放出Cyt-C等因子，在與凋亡蛋白酶活化因子結合后，能夠激活凋亡蛋白酶Caspase-9，促使半胱天冬氨酸與其結合，從而形成凋亡小體。Caspase是一組龐大的凋亡蛋白酶家族，能夠通過線粒體途徑被激活，而活化的Caspase還能夠引起線粒體釋放出更多的Cyt-C，該家族“瀑布式”的激活鏈將最終引起細胞走向凋亡。Caspase-9處于“瀑布式”激活鏈的頂端，被激活后的Caspase-9將引起下游Caspase-3等效應分子的活化，引發Caspase級聯反應，導致細胞核染色質固縮、裂解以及和胞體分離形成凋亡小體等[25-27]。本研究發現FGEPS能夠誘導SGC-7901細胞凋亡，且線粒體介導的細胞凋亡途徑在FGEPS誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡過程中具有重要作用。多糖作為天然高分子物質，不只是結構、能量物質的基本成分，更是參與機體調控、應答的關鍵分子[28-30]。隨著糖生物學的發展，多糖因為具有良好的抗腫瘤活性而成為抗腫瘤藥物的研究熱點。

綜上所述，本研究首次從禾谷鐮刀菌中分離出胞外多糖FGEPS，其對SGC-7901、BGC-823和MGC-803均有增殖抑制效果，且對SGC-7901抑制效果最為顯著，并能通過線粒體通路誘導SGC-7901細胞發生凋亡。實驗為進一步探討FGEPS抗胃癌作用的研究提供依據，為開發多糖類胃癌輔助治療藥物提供實驗基礎。