基于miR-320/E2F轉錄因子1軸探討天南星提取物對肺癌細胞順鉑耐藥的影響及相關機制

劉雪嬌，張雪云，張勇

肺癌是臨床常見的癌癥類型，其好發于40歲及以上人群，以惡性程度高、侵襲及轉移性強為主要特征［1］。相關數據顯示，全球超過1/3的肺癌患者在我國，且近年我國肺癌發病率有持續增長趨勢，每年因肺癌死亡人數超過60萬，其已成為我國癌癥發病及死亡的首要原因［2］。肺癌早期常以手術切除為主要治療方案，手術切除原發病灶可達到臨床治愈或縮小腫瘤體積的目的；肺癌中晚期及轉移患者標準治療方案則是以順鉑為基礎的兩種聯合化療方案，其可明顯延長患者生存期，但長期使用順鉑會引發腫瘤耐藥，進而影響化療效果［3］。天南星提取物是中藥天南星的主要活性成分集合物，具有抗驚厥、鎮靜、止痛、抗氧化等多重藥理活性，近年其被發現有一定抗腫瘤活性［4］。有研究發現，天南星提取物可抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡，從而對胃癌大鼠發揮治療作用［5］。但目前關于天南星提取物對肺癌細胞順鉑耐藥的影響及相關機制鮮有報道。本研究采用天南星提取物干預肺癌細胞，觀察其對順鉑耐藥的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 本實驗時間為2020年9月至2021年6月。人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細胞系、人支氣管上皮16HBE細胞系購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 天南星提取物（蘭州沃特萊斯生物科技有限公司），qRT-PCR試劑盒、LipofectamineTM3000試劑盒、miR-320抑制質粒、雙熒光素酶檢測試劑盒、MTT試劑盒購自上海群己生物科技有限公司，兔抗人E2F轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）一抗購自美國CST公司，7300 qRT-PCR儀購自美國ABI公司，Spark酶標儀購自瑞士Tecan公司，FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 細胞培養 分別將A549/DDP細胞、16HBE細胞置于RPMI 1640培養基（含10% FBS、1%青鏈霉素）中，在培養箱標準條件下（37 ℃，5% CO2）培養，A549/DDP細胞額外加入順鉑（終濃度為1 mg/L），隔天換液，待細胞融合至80%，胰酶消化后傳代培養，取對數期細胞用于后續實驗。

1.4 轉染及分組［6］取對數期A549/DDP細胞分為空白組和天南星組，空白組置于RPMI 1640培養基中常規培養，天南星組置于加入天南星提取物（終濃度為8 mg/ml）的RPMI 1640培養基中常規培養。另取對數期A549/DDP細胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，調整細胞密度為1×106個/ml，接種至6孔板，待細胞融合至80%，根據LipofectamineTM3000試劑盒說明書操作轉染步驟，將miR-320抑制質粒轉染至A549/DDP細胞，隨機分為轉染組、轉染聯合天南星組，轉染組置于RPMI 1640培養基中常規培養，轉染聯合天南星組置于加入天南星提取物（終濃度為8 mg/ml）的RPMI 1640培養基中常規培養。培養48 h后進行后續實驗，每組細胞設置5個復孔。

1.5 qRT-PCR檢測miR-320相對表達量 分別取對數期A549/DDP細胞、16HBE細胞，經Trizol法提取總RNA，采用Promega試劑盒反轉錄為cDNA，以U6為內參，定量后按照qRT-PCR試劑盒說明書要求設定反應體系：雙倍核酸染料12 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μl，cDNA 1 μl，加雙蒸水至總體積為20 μl。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性50 s，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，重復35個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-320相對表達量。miR-320上游引物：5'-TCCTTTTTCGCCCTCTCAAC-3'，下游引物：5'-CTCCCCTCCGCCTTCTCTT-3'；U6上游引物：5'-GAATCGGGCCTGCTCAAGT-3'，下游引物：5'-CGAAACGGAGACCCAGGAAA-3'。培養48 h后，分別取空白組、天南星組、轉染組、轉染聯合天南星組細胞，檢測miR-320相對表達量，方法同上。

1.6 MTT法檢測細胞增殖抑制率、細胞半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50） 培養48 h后，分別取空白組、天南星組、轉染組、轉染聯合天南星組細胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，調整細胞密度為1×105個/ml，接種至6孔板，待細胞融合至80%，分別加入不同濃度（2、4、8、16、32 μg/ml）順鉑至RPMI 1640培養基中，干預48 h后加入MTT溶液（20 μl/孔，5.00 g/L），靜置2 h，吸去上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl/孔，振蕩至結晶溶解，采用酶標儀檢測各孔490 nm位置吸光度值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=（1-觀察孔吸光度值/對照孔吸光度值）×100%。繪制折線圖以計算順鉑對各組細胞IC50。實驗重復3次取平均值。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 培養48 h后，分別取空白組、天南星組、轉染組、轉染聯合天南星組細胞，PBS洗滌，胰酶消化重懸，低溫離心10 min（3 000 r/min，離心半徑8 cm），吸去上清，根據Annexin V-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作實驗步驟，采用binding buffer緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC、PI各5 μl并混勻，避光孵育10 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次取平均值。

1.8 雙熒光素酶實驗驗證miR-320與E2F1的靶向關系 經靶基因預測數據庫TargetScan預測，E2F1 3'UTR可能存在與miR-320結合的位點，鑒定工作在上海群己生物科技有限公司進行。分別構建E2F1野生型和突變型3'UTR，并將其命名為E2F1 3'-UTR-WT、E2F1 3'-UTR-MT，分別插入至雙熒光素酶載體，與miR-320質粒（miR-320 mimic-NC、miR-320 mimic）共轉染至293T細胞，分為作為E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRMT+miR-320 mimic組。轉染24 h后收集細胞，經雙熒光素酶檢測試劑盒測定各組熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。實驗重復3次取平均值。

1.9 Western blotting法檢測E2F1蛋白相對表達量 培養48 h后，分別取空白組、天南星組、轉染組、轉染聯合天南星組細胞，采用RIPA液裂解細胞，低溫離心15 min（10 000 r/min，離心半徑10 cm），經BCA試劑盒測定總蛋白。取40 μg樣本蛋白，與上樣緩沖液等比例混合，沸水浴變性蛋白，同參數離心取上清液，行凝膠電泳分離、濕法轉膜，采用BSA液封閉2 h，加入兔抗人E2F1一抗（1∶500），4 ℃冰箱冷藏過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，浸入ECL發光液發光，置于暗室顯色，經凝膠成像儀拍照分析，并計算E2F1蛋白相對表達量，E2F1蛋白相對表達量=E2F1蛋白條帶灰度值/內參GAPDH灰度值。實驗重復3次取平均值。

1.10 統計學方法 應用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同細胞系miR-320相對表達量比較 16HBE細胞系miR-320相對表達量為（0.93±0.10），高于A549/DDP細胞系的（0.28±0.03），差異有統計學意義（t=13.921，P＜0.001）。

2.2 四組miR-320相對表達量比較 空白組miR-320相對表達量為（0.27±0.02），天南星組為（1.57±0.09），轉染組為（0.11±0.01），轉染聯合天南星組為（0.49±0.06）。四組miR-320相對表達量比較，差異有統計學意義（F=711.257，P＜0.001）。與空白組比較，天南星組miR-320相對表達量升高，轉染組降低，差異有統計學意義（t值分別為31.530、16.000，P值均＜0.001）；與天南星組比較，轉染聯合天南星組miR-320相對表達量降低，差異有統計學意義（t=22.326，P＜0.001）；與轉染組比較，轉染聯合天南星組miR-320相對表達量升高，差異有統計學意義（t=13.969，P＜0.001）。

2.3 四組細胞增殖抑制率、IC50及細胞凋亡率比較 四組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率、IC50及細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與空白組比較，天南星組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高、IC50降低，轉染組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低、IC50升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與天南星組比較，轉染聯合天南星組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低，IC50升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與轉染組比較，轉染聯合天南星組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高，IC50降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1～2。

圖1 四組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率變化的折線圖Figure 1 Broken line diagram of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment among the four groups

圖2 四組流式細胞術檢測的細胞凋亡情況Figure 2 Apoptosis detected by flow cytometry among the four groups

表1 四組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率、IC50及細胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment，IC50 and apoptosis rate among the four groups

表1 四組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率、IC50及細胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of inhibition rate of cell proliferation after different concentrations of cisplatin treatment，IC50 and apoptosis rate among the four groups

注：IC50=半數抑制濃度；a表示與空白組比較，P＜0.05；b表示與天南星組比較，P＜0.05；c表示與轉染組比較，P＜0.05

組別細胞增殖抑制率（%） IC50（μg/ml）細胞凋亡率（%）2 μg/ml順鉑處理 4 μg/ml順鉑處理 8 μg/ml順鉑處理 16 μg/ml順鉑處理 32 μg/ml順鉑處理空白組 16.45±2.02 33.47±3.40 46.64±4.66 52.38±7.26 65.16±7.09 12.05±2.61 4.01±0.26天南星組 36.14±3.65a 58.02±6.69a 69.90±8.39a 79.58±8.36a 88.53±7.63a 3.38±0.48a 37.56±5.05a轉染組 8.78±1.05a 19.23±2.66a 28.98±3.55a 39.84±4.86a 53.62±6.23a 29.54±4.02a 1.77±0.18a轉染聯合天南星組 20.20±2.57bc 44.64±3.33bc 53.61±6.42bc 64.45±3.04bc 76.96±7.67bc 6.47±0.80bc12.91±1.88bc F值 105.777 72.941 39.380 37.058 21.960 144.522 184.330 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組雙熒光素酶實驗結果比較 雙熒光素酶實驗結果顯示，E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic組相對熒光素酶活性分別為（1.30±0.14）、（1.29±0.15）、（1.30±0.15）、（0.92±0.11）。與E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic組比較，E2F1 3'-UTR-WT+miR-320 mimic-NC組、E2F1 3'-UTRWT+miR-320 mimic組、E2F1 3'-UTR-MT+miR-320 mimic-NC組相對熒光素酶活性升高，差異有統計學意義（t值分別為4.772、4.448、4.568，P值均＜0.05）。E2F1是miR-320的一個靶基因，兩者結合位點為E2F1的3'-UTR片段，見圖3。

圖3 生物信息學分析結果Figure 3 Bioinformatics analysis results

2.5 四組E2F1蛋白相對表達量比較 空白組、天南星組、轉染組及轉染聯合天南星組E2F1蛋白相對表達量分別為（0.27±0.04）、（0.13±0.01）、（0.88±0.10）、（0.72±0.07）。四組E2F1蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（F=153.655，P＜0.001）；與空白組比較，天南星組E2F1蛋白相對表達量降低，轉染組升高，差異有統計學意義（t值分別為7.593、13.664，P值均＜0.001）；與天南星組比較，轉染聯合天南星組E2F1蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（t=18.657，P＜0.001）；與轉染組比較，轉染聯合天南星組E2F1蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義（t=2.931，P=0.019），見圖4。

圖4 Western blotting法檢測四組E2F1蛋白相對表達量的凝膠電泳圖Figure 4 Gel electrophoresis map of the relative expression of E2F1 protein among the four groups detected by Western blotting

3 討論

肺癌是發源于支氣管黏膜上皮組織的肺原發性惡性腫瘤，起初沿主支氣管壁或段支氣管壁浸潤生長，后向周圍肺組織擴張，繼續沖擊臟層胸膜并擴散到胸壁、膈肌，最終通過肺部各淋巴結及上腔靜脈轉移至腦、肝、腎等全身各處器官［7］。吸煙是肺癌的主要危險因素之一，此外，職業環境、電離輻射、肺部疾病及遺傳等也是其重要影響因素［8］。肺癌早期常表現為呼吸系統癥狀，以咳嗽、低熱、胸痛為主，后發展為咯血、面部水腫、聲嘶、消瘦，并隨著病灶遠端轉移部位不同而伴有顱內壓增高、肝腫大、腰痛等臨床表現［9］。肺癌多因癥狀不明而未能早期發現，多數患者確診時已出現遠端轉移，此時化療是最有效的治療手段，其中順鉑是肺癌的一線化療藥物，其釋放的鉑離子可與細胞DNA鏈內交聯，形成復合體，影響DNA復制，從而抑制癌細胞增殖，但癌細胞可降低順鉑吸收率、修復自身損傷DNA，從而產生耐藥性，影響化療效果［10］。因此，尋找可逆轉肺癌細胞順鉑耐藥的藥物或手段對改善患者預后、降低病死率意義重大。

中醫治療肺癌具有獨特優勢，肺癌歸于中醫學“肺積”“息賁”“肺萎”“咯血”等范疇，為五積之一，其主要病機為稟賦不足、情志失調、邪毒侵入、傷于肌表、由表入里、血行不暢、瘀血阻滯，以致脾胃失職、聚濕生痰、痰聚于肺、肺行水失職，終因毒聚邪留、氣機紊亂、發為肺積，故治療應以祛濕化痰、清肺健脾為主［11］。中藥天南星取自天南星科植物天南星、異葉天南星、東北天南星等塊莖，性溫，味苦、辛，歸肺、肝、脾經，可化痰、散結、燥濕、消腫［12］?！侗窘浄暝罚?3］中記載，天南星可治寒熱、結氣、利胸膈，治積聚伏梁、破堅積。天南星提取物含有植物多糖、生物堿類、黃酮類、脂肪酸類等多種天然化合物，有研究表明其與半夏配伍可抑制腫瘤血管生成、降低肺癌細胞耐藥性、誘導肺癌細胞周期停滯，進而發揮抗腫瘤效應，提示其對肺癌具有潛在治療作用［14］。本研究結果顯示，與空白組比較，天南星組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高、IC50降低，轉染組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低、IC50升高；與天南星組比較，轉染聯合天南星組不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率降低，IC50升高；與轉染組比較，轉染組聯合天南星不同濃度順鉑處理后細胞增殖抑制率和細胞凋亡率升高，IC50降低，提示天南星提取物可逆轉肺癌細胞順鉑耐藥，促進肺癌細胞凋亡，其機制可能與天南星提取物調控miR-320有關。

miRNA是細胞內重要的非編碼調控因子，可調控眾多基因表達轉錄，范圍涉及機體的整個生命過程，且因數量及分子量少，常被作為腫瘤耐藥及預后評估的特異性分子標志物。miR-320是新發現的保守型miRNA，其在乳腺癌、結直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達，作為一種抑癌因子在腫瘤的發生與發展過程中扮演著重要角色［15］。E2F1是E2F家族轉錄因子家族成員，具有額外細胞周期蛋白結合域，可改變細胞周期，調控細胞凋亡過程，誘導細胞上皮間質轉化，提高細胞侵襲、遷移能力，具有一定促癌作用［16］。劉延鋒等［17］研究表明，過表達miR-320可抑制E2F1基因表達，從而抑制結直腸癌腫瘤細胞糖代謝，提示miR-320-E2F1軸在惡性腫瘤中具有一定作用。本研究結果顯示，與16HBE細胞系比較，A549/DDP細胞系miR-320相對表達量降低，提示miR-320在肺癌細胞中呈低表達；雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-320與E2F1存在結合位點，E2F1是其靶向調控基因之一。本研究結果還顯示，與空白組比較，天南星組E2F1蛋白相對表達量降低，轉染組升高；與天南星組比較，轉染聯合天南星組E2F1蛋白相對表達量升高；與轉染組比較，轉染聯合天南星組E2F1蛋白相對表達量降低，提示天南星提取物逆轉肺癌細胞順鉑耐藥可能與調控miR-320，進而調控下游靶基因E2F1表達有關。

綜上所述，天南星提取物可逆轉肺癌細胞順鉑耐藥，促進肺癌細胞凋亡，其機制可能與通過調控miR-320，進而靶向下調E2F1表達有關。

作者貢獻：劉雪嬌進行文章的構思與設計；劉雪嬌、張雪云進行研究的實施與可行性分析，負責撰寫、修訂論文；劉雪嬌、張雪云、張勇進行數據收集、整理、分析；劉雪嬌、張勇進行結果分析與解釋；張雪云負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。