宏基因組二代測序診斷赤曲霉所致侵襲性肺曲霉菌病一例報道并文獻復習

劉美紅，張杰，董暢，劉卓，李艷霞，于麗艷

侵襲性肺曲霉菌病是一種致命的呼吸系統疾病，在免疫缺陷人群中病死率高達40%～90%，其最常見的病原體是黑曲霉、土曲霉、煙曲霉、黃曲霉和構巢曲霉［1］。近年來，隨著分子生物學技術的發展，已經有30多種新的曲霉種類被報道可引起侵襲性肺曲霉菌病［2-3］。赤曲霉是一種海洋來源的絲狀真菌，屬于曲霉菌屬，其在37 ℃ M60Y培養基上生長良好，菌落邊緣呈灰白色，中間呈棕褐色；反面呈淡黃色至橘黃色。40倍顯微鏡下，可觀察到大量孢子堆和分生孢子；分生孢子呈球狀，直徑為2～4 μm［4］。赤曲霉在室內環境以及灰塵中被廣泛報道［5-6］，除此以外，赤曲霉還在多種植物種子、煙草、食物以及飼料中被檢測到［7-10］。關于赤曲霉對人類的致病作用，目前尚未見確切的報道，僅在神經性厭食患者的糞便中發現了赤曲霉［11］；一項研究在兩位養牛農民的血清中發現了赤曲霉抗體，同時在一例“農民肺”患者接觸的干草中分離出赤曲霉，提示赤曲霉可能會引起呼吸系統疾病［12］。本文報道了1例赤曲霉感染所致侵襲性肺曲霉菌病患者，通其過宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）確診，這是首次應用mNGS從臨床樣本中直接檢測到赤曲霉，現報道如下。

1 病例簡介

患者，男，48歲，主因“反復咳嗽咳痰半年，加重伴咯血1個月”于2021-02-08來大連醫科大學附屬第一醫院呼吸與重癥醫學科就診。患者于2020年9月起出現反復咳嗽、咳白色泡沫痰，伴胸悶氣促，未系統診治。2021年1月咳嗽、咳痰加重，伴間斷咯血。發病以來無發熱，曾口服頭孢地尼、阿莫西林克拉維酸鉀、阿奇霉素及莫西沙星等抗感染治療，均未見明顯好轉。追問病史，患者起病前曾多次出入一所空置多年的廢棄樓宇，其內散布多年未打掃的木板、發霉的米、面，灰塵密布。

患者既往體健，入院查體：體溫36.7 ℃，脈搏70次/min，呼吸頻率18次/min，血壓120/70 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。雙肺吸氣末可聞及濕啰音及干鳴音。實驗室檢查：紅細胞沉降率17 mm/1 h，免疫球蛋白（immune globulin，Ig）E 220 U/ml，血常規檢查指標、降鈣素原（procalcitonin，PCT）均處于參考范圍，G試驗、GM試驗、曲霉菌抗體均陰性。胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影（見圖1A～1C）。支氣管鏡檢查顯示，左上舌葉見血性分泌物，肺泡灌洗液涂片見真菌菌絲，見圖2。本例患者既往應用多種抗生素治療效果不佳，考慮罕見病原體感染可能性大，故取得患者同意后，留取肺泡灌洗液行mNGS。收集5 ml肺泡灌洗液至無菌離心管中，置于-20 ℃冰箱保存。干冰快遞至深圳華大基因科技有限公司進行mNGS，主要過程包括核苷酸提取、文庫構建、測序和生物信息學分析［13］。取600 μl肺泡灌洗液加入玻璃珠和酶混合震蕩后按照TIANamp Micro DNA Kit試劑盒〔DP316，天根生化科技（北京）有限公司〕步驟提取DNA，提取后的DNA被超聲破碎成小片段，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質控文庫插入片段（大小為200～300 bp），使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）質控DNA文庫濃度，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫通過滾環復制生成DNB納米球，將制備好的DNB納米球加載到測序芯片，通過BGISEQ-50測序儀進行測序［14］，測序數據下機后去除低質量的序列（長度＜35 bp）以獲得高質量的數據，通過BWA（http//bio-bwa.sourceforge.net/）比對將高質量數據中比對上的人參考基因組（hg19）序列去除［15］，剩下的數據在去除低復雜度reads后與PMDB數據庫（包括6 350種細菌、4 945種病毒、1 064種真菌、234種寄生蟲）進行比對。最后從完整的微生物列表中刪除可疑的背景微生物，再根據LANGELIER等［16］研究確定病原學診斷標準，計算微生物相對豐度并依次排序。

圖1 患者住院及隨訪時胸部CT檢查結果Figure 1 The chest CT results of patient hospitalized and followed up

圖2 患者肺泡灌洗液涂片結果Figure 2 Alveolar lavage fluid smear results of patient

mNGS結果顯示，10條序列比對到曲霉菌屬，其中5條嚴格比對到赤曲霉，基因組覆蓋率為0.001 6%，見圖3。根據mNGS結果調整抗生素為伏立康唑（Pharmacia ＆ Upjohn Company生產，進口藥品注冊證號H20181102，規格：200 mg）靜脈滴注200 mg/次，2次/d，抗真菌治療，治療6 d后患者咳嗽、咳痰、咯血、氣促癥狀明顯緩解。復查胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影較前好轉，見圖1D～1F，患者出院。出院后患者口服伏立康唑片（患者自購）200 mg/次，2次/d，共治療1個月。3個月后復查胸部CT檢查顯示，雙肺上葉及左舌葉周邊磨玻璃樣密度影被吸收，見圖1G～1I。

圖3 患者mNGS結果Figure 3 Metagenomic next-generation sequencing result of patient

2 討論

本研究以赤曲霉為檢索詞在中國知網、維普網、萬方數據知識服務平臺、PubMed等數據庫進行檢索，未檢索到赤曲霉對人類致病的報道。一項多中心研究中，納入了332株臨床標本分離出來的曲霉菌，鑒定發現有一株為赤曲霉［17］，雖然未說明其臨床標本類型，但是這一結果提示赤曲霉可能引起人類感染。另一項研究在兩位養牛農民的血清中發現了赤曲霉抗體，進一步證實了赤曲霉對人類的致病性；同時該研究還在一例“農民肺”患者接觸的干草中分離出赤曲霉，提示赤曲霉可能作為致敏原引起外源性過敏性肺泡炎［12］。

赤曲霉作為曲霉菌的一種，廣泛存在于室內環境、灰塵以及發霉的食物中，對人體表現出侵襲性和致敏性兩種致病效應。本例患者起病前及起病初期有明確的發霉米面以及室內灰塵接觸史，臨床癥狀以咳嗽、咳血痰為主，支氣管鏡檢查顯示，左上舌葉見血性分泌物，表現出氣管侵襲性；同時本例患者胸部CT檢查顯示，雙肺多發磨玻璃影，亦符合曲霉菌致敏后炎癥滲出表現。最后，應用mNGS對肺泡灌洗液中病原菌進行了準確的診斷，最終mNGS顯示，5條嚴格比對到赤曲霉，未發現其他真菌，考慮到真菌細胞壁厚，核酸提取困難，所以雖然比對到赤曲霉的序列數較少也應該考慮其致病可能。單玉璋等［18］曾報道了1例波氏假阿利什霉肺部感染患者，mNGS亦僅檢測到5條波氏假阿利什霉序列。LI等［19］報道了1例mNGS僅檢測到2條序列的屎腸球菌感染患者，經PCR復核確診。基于上述研究，即使有些病原體檢出序列相對較少，但仍不能放松警惕。除此以外，赤曲霉檢出序列數少還可能與標本中病原體本身載量負荷較小以及人源序列比例較高相關。本例患者僅檢測到赤曲霉一種真菌，未發現其他類別真菌，根據MIAO等［20］研究中提出的病原體讀取標準：mNGS鑒定出一種微生物（物種水平）的覆蓋率比其他真菌高5倍即可診斷，所以本例患者赤曲霉感染的可信度較高。遺憾的是，本研究未在肺泡灌洗液和痰液中分離和培養出赤曲霉，這可能與樣本中含有赤曲霉的細胞數量較少有關。

本例患者最終依靠mNGS確診，進一步證實了mNGS在感染性疾病診斷方面的巨大潛力，極大地提高了病原體的檢測能力，有助于識別新的病原體［21］。mNGS作為一種新興的分子生物學技術，可以直接從患者的臨床樣本中檢測所有潛在的病原體，相比于傳統的微生物檢測技術，mNGS可以快速準確地獲取致病微生物信息，受前期抗生素應用的影響很小。有研究表明，mNGS診斷肺部混合感染的靈敏度高于常規檢測（97.2%比13.9%）［22］，且mNGS與血培養的診斷符合率達93.7%［23］，在分析免疫缺陷患者時，mNGS檢測準確率甚至可能達到100%［24］。由于mNGS對致病微生物的精準分類，很大程度上避免了抗生素的濫用，有助于優化抗生素方案。mNGS還能鑒定出多種難以培養的病原體，包括非結核分枝桿菌、奴卡菌以及各種放線菌［20，25］。與此同時，mNGS也面臨著較多問題，包括成本昂貴、結果判讀困難等，但在疑難雜癥、危重癥、免疫缺陷等特殊人群中，mNGS仍具有成為病原體診斷準一線檢測手段的潛力，是一種有效的廣譜病原體篩查方法［26］。

綜上所述，本研究通過mNGS確診了1例赤曲霉感染所致侵襲性肺曲霉菌病患者，mNGS為本例患者快速明確診斷提供了強有力的技術支持。本例患者讓臨床醫生對致病曲霉菌譜有了新的認識，同時也進一步證實了mNGS在感染性疾病診斷方面的巨大潛力，尤其是對罕見或新發病原體的診斷。

作者貢獻：劉美紅、于麗艷進行文章的構思與設計；劉美紅進行文章的可行性分析，撰寫論文；張杰、董暢進行文獻、資料的收集與整理；劉卓、李艷霞進行論文的修訂；于麗艷負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。