橙皮素通過Nrf2/HO-1 信號通路對非酒精性脂肪肝體外模型氧化應激的保護作用

羅 娟樓迪棟肖巧巧李曉潔李 毅周誼霞*

(1.貴州中醫藥大學護理學院,貴陽 550025;2.貴州醫科大學護理學院,貴陽 550001;3.貴州中醫藥大學基礎醫學院,貴陽 550025;4.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室,貴陽 550001)

我國是世界上非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病率增長最快的國家,也是亞洲患病率、發病率、死亡率最高的國家[1-2]。NAFLD 發病機制復雜[3],且目前尚無特異性治療藥物。 氧化應激是NAFLD 的主要發病機制,肝發生氧化應激后會觸發肝炎癥,增加肝受損程度[4-5]。 因此,減輕肝的氧化應激水平,可能為防治NAFLD 帶來新思路。 核因子E2 相關因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是機體重要的抗氧化因子[6],可調節下游血紅素加氧酶-1(HO-1)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)以及醌氧化還原酶(NQO1),發揮抗氧化作用[7-8]。 已有多項研究報道Nrf2 信號通路對NAFLD 具有保護作用[9-10]。 橙皮素(hesperetin,HES)是一種富含于柑橘類水果中的生物類黃酮,是對抗超氧化物和羥基自由基的有效藥物[11-12],但是其能否通過影響Nrf2/HO-1 信號通路緩解NAFLD 尚不明確,本研究旨在通過體外NAFLD 模型探討HES 是否緩解NAFLD,并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

人正常肝細胞LO2 購自上海中喬新舟生物科技有限公司,貨號ZQ0031。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8、油酸(OA)購于大連美侖生物技術有限公司,貨號MA0218-2、MB2405;HES 購于上海麥克林生化科技有限公司,純度97%,貨號C10358475;飽和油紅O 染液,購于索萊寶科技有限公司,貨號G1260;丙二醛(MDA)測定試劑盒(TBA 法)購于萬類生物科技,貨號為WLA048a;ROS、SOD、CAT 測試試劑盒購于南京建成科技有限公司,貨號E004-1-1、A001-3、A007-1-1;Nrf2、GCLC、NQO1、HO-1、β-actin以及羊抗兔IgG 均購于Affinity 公司,貨號AF0639、DF8550、DF6437、AF5393、S0001。 冷凍離心機,美國Thermo Fisher 公司,型號Heraeus Fresco 21;多功能酶標儀,美國Bio-Tek 公司,型號ELX800UV;正置光學顯微鏡,日本Nikon 公司,型號Nikon Eclipse E100;倒置熒光顯微鏡,日本Nikon 公司;電泳儀,武漢賽維爾生物科技有限公司,型號BV-2。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

LO2 細胞培養于含10% FBS 及1%雙抗的DMEM 培養基中,將其置于含5% CO2的37℃恒溫培養箱中,2～3 d 換液1 次,當細胞密度達80%～90%時用胰酶消化,按1 ∶3 進行傳代。

1.3.2 細胞活力分析

以每孔1.0×104個細胞接種于96 孔板中,待細胞貼壁后,將OA 和HES 以濃度梯度分組給藥,繼續培養24 h,采用CCK-8 法測定細胞活力。

1.3.3 細胞分組

將LO2 細胞分為正常對照組(NC,正常培養基培養)、模型組(Model,0.125 mmol/L 的OA 造模)、HES 低、中、高劑量組(L-HES、M-HES、H-HES,10、100、200 μmol/L 的HES 干預24 h)。

1.3.4 油紅O 染色及定量

4%多聚甲醛固定30 min,60%異丙醇快速浸洗,油紅O 染液室溫染色10 min,60%異丙醇分化10 s,洗去多余染料,蘇木素復染細胞核10 s,PBS 清洗兩遍,于倒置顯微鏡觀察細胞脂質蓄積情況。 每孔加入500 μL 異丙醇,于脫色搖床上振蕩10 min,取100 μL 上清液于96 孔板中,在500 nm 處測OD 值。

1.3.5 抗氧化指標(ROS、MDA、SOD、CAT)測定

收集細胞于EP 管中,加入PBS,超聲裂解細胞,4℃,12000 r/min,離心10 min,取上清液測定。具體操作步驟按測定試劑盒說明書進行,ROS 染色后置于熒光顯微鏡下拍攝。

1.3.6 Western blot 檢測

將LO2 細胞收集至EP 管中,加入RIPA 裂解液,超聲裂解細胞,4℃,12000 r/min,離心20 min,提取細胞總蛋白。 蛋白樣品用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,電泳結束進行轉膜、封閉,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。 最后用化學發光檢測系統進行蛋白顯影。 蛋白密度值用Image J 軟件進行分析。

1.4 統計學方法

用SPSS 22.0 進行統計學分析,用Graphpad Prism 8 繪制統計圖。 符合正態分布的數據用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較用單因素方差分析,組間比較用LSD-t檢驗。 以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活力分析結果

與0 mmol/L 相比,當OA 濃度在0.5 ～ 2.0 mmol/L 時細胞活力下降(P＜0.01);與0 μmol/L 相比,當HES 濃度達到250 μmol/L 時,抑制細胞活力(P＜0.05)。 因此,后續實驗選用0.125 mmol/L 的OA,10、100、200 μmol/L 的HES。 見圖1。

圖1 不同濃度OA 及HES 對LO2 細胞活力的影響Note. A, Effect of different concentrations of OA on LO2 cell viability. B, Effect of different concentrations of HES on LO2 cell viability.Compared with 0 mmol/L, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 1 Effect of different concentrations of OA and HES on the viability of LO2 cells

2.2 HES 呈劑量依賴性減少LO2 細胞內脂滴的形成

與NC 組相比,Model 組細胞內的脂滴形成明顯增多,可見細胞內大面積紅染;與Model 組相比,各HES 組脂滴形成均明顯減少,隨著劑量的增加,各HES 組內的紅染面積逐漸減少。 油紅O 定量結果與上述結果一致。 見圖2。

圖2 HES 對LO2 細胞內脂質蓄積的影響(油紅O)Note. A, Oil red O staining. B, Oil red O quantification. 1, Normal control group. 2, Model group. 3, Hesperidin low dose group. 4, Hesperidin medium dose group. 5, Hesperidin high dose group. Compared with NC group, **P＜0.01. Compared with Model group, ##P＜0.01.Figure 2 Effect of HES on intracellular lipid accumulation in LO2 cells (Oil Red O)

2.3 HES 減輕LO2 細胞的氧化應激

與NC 組相比,Model 組ROS、MDA 生成增加,SOD、CAT 生成減少(P＜0.01);與Model 組相比,高、中、低劑量HES 組MDA、ROS 生成逐漸減少,SOD、CAT 生成增多(P＜0.5)。 見圖3。

2.4 HES 對增加Nrf2/HO-1 信號通路表達

與NC 組相比,Model 組HO-1、NQO1、GCLC、Nrf2 表達減少(P＜0.05);與Model 組相比,HES 低、中、高劑量組上述蛋白表達水平逐漸升高(P＜0.05)。 見圖4。

圖4 HES 對LO2 細胞HO-1、NQO1、GCLC、Nrf2 蛋白表達的影響Note. A, Protein bands of Nrf2, HO-1. B, Protein expression of Nrf2. C, Protein expression of HO-1. D, Protein bands of GCLC,NQO1. E, Protein expression of GCLC. F, Protein expression of NQO1. 1, NC group. 2, Model group. 3, L-HES group. 4, M-HES group. 5, H-HES group. Compared with NC group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with Model group, #P＜0.05,##P＜ 0.01.Figure 4 Effect of HES on HO-1, NQO1, GCLC, Nrf2 protein expression in LO2 cells

3 討論

目前NAFLD 仍無特異性治療藥物,“二次打擊學說”指出了氧化應激在NAFLD 發病機制中的重要性,因此控制氧化應激有助于延緩NAFLD 進程。HES 可以抗氧化和清除自由基,在NAFLD 防治方面具有廣闊前景[13],但是目前還沒有其他研究報道過HES 對NAFLD 模型脂質氧化及對Nrf2/HO-1 信號通路的影響。 本研究利用LO2 細胞作為NAFLD體外模型,研究HES 對NAFLD 的作用及其機制。結果表明,模型組中脂滴大量形成,ROS 和MDA 生成增加,SOD 和CAT 含量減少,Nrf2/HO-1 信號通路蛋白表達水平減少,提示NAFLD 體外氧化應激模型成功建立。

MDA 是機體脂質過氧化的主要代謝產物,具有細胞毒性;ROS 可以誘導多不飽和脂肪酸啟動細胞內的脂質過氧化,擴大氧化應激影響范圍[14],兩者生成量增多會損傷肝。 SOD 是生物體內最重要的抗氧化酶[15],CAT 參與活性氧代謝過程,二者與POD 組成清除自由基的反應體系[16]。 本研究發現,HES 呈劑量依賴性減少NAFLD 模型脂滴的形成,降低MDA 和ROS 的生成,增加抗氧化酶SOD、CAT 的含量,抵抗NAFLD 體外模型的氧化應激,發揮保護作用。 Kheradmand 等[17]、Chen 等[18]的研究也表明HES 在阿爾茲海默病和腎損傷模型中具有減少ROS、MDA,增加SOD、CAT 生成的作用,這與我們的研究結果一致。 以上的實驗結果提示,HES可能通過減輕NAFLD 體外模型的氧化應激水平,發揮肝保護作用。

Nrf2/HO-1 信號通路是機體抵御氧化應激的重要信號通路,其激活可以促進下游多個抗氧化因子的表達[19],可以治療多種氧化損傷疾病。 Nrf2 是氧化應激的中樞細胞感受器;HO-1 可以將血紅素分解為具有抗氧化能力的膽綠素、一氧化碳和游離鐵[20];NQO1 可以催化醌類及其衍生物還原,降解其毒性,從而阻止氧化還原反應和ROS 生成[21];GCLC 是GCL 的組成亞單位,而GCL 是細胞GSH的合成限速酶,可以調控GSH 生成的量和速度,從而保護細胞免受氧化應激傷害。 為進一步研究HES 的在NAFLD 體外模型中的抗氧化作用機制,進行蛋白免疫印跡實驗檢測Nrf2/HO-1 信號通路的表達情況。 Parhiz 等[22]、Wan 等[23]及Prema 等[24]的研究分別在藥物肝損傷模型和心臟肥大模型中探討HES 對Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1 表達的影響,他們的研究結果均表明HES 可以增加上述蛋白的表達并對疾病起到保護作用。 本研究對HES 在體外NAFLD 模型中的抗氧化作用進行研究,證明了HES 可以降低脂質蓄積,減少氧化應激產物的生成,并發現HES 可以增加Nrf2、HO-1、GCLC、NQO1的蛋白表達量,這表明HES 對NAFLD 的體外氧化應激模型具有保護作用。

綜上所述,HES 對NAFLD 的體外氧化應激模型具有保護作用,其作用機制可能與增加Nrf2/HO-1 信號通路表達有關。