弗氏完全佐劑肌肉注射誘發(fā)炎性痛敏及免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

石驚濤張曉寧曹婉縈何 偉劉一寒王 睿宿楊帥萬(wàn)紅葉曲正陽(yáng)景向紅王曉宇*

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所,北京 100700;2.北京理工大學(xué),北京 100081)

將弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)注射到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同組織中(如關(guān)節(jié)[1]、足底[2]、尾根[3]、肌肉[4])是基礎(chǔ)研究中最常用的炎癥模型造模方法。 它能夠誘導(dǎo)局部發(fā)生強(qiáng)烈而持久的炎癥反應(yīng),并伴隨著劇烈疼痛[5],同時(shí)CFA 也是許多自身免疫性疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型誘導(dǎo)方案中不可替代的組成部分[6]。 CFA 注射部位中較常見(jiàn)的是足底注射,用于觀察急性和慢性炎癥所帶來(lái)的痛覺(jué)過(guò)敏和原發(fā)痛行為[7],以及慢性炎性痛誘發(fā)的焦慮抑郁樣情緒行為[8]。 其次是關(guān)節(jié)腔內(nèi)或尾根部皮下注射CFA[1,3,9],常用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究[10]。 肌肉注射CFA 則較多的運(yùn)用于抗體的制備[11]。 近幾年來(lái),在肌肉中注射CFA 并觀察肌肉炎性疼痛和反應(yīng)的研究逐漸增多,相關(guān)研究較多的聚焦于CFA 誘發(fā)的肌肉炎性反應(yīng)所帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)上的改變[12-13],而對(duì)肌肉炎性反應(yīng)中免疫應(yīng)答的病理生理過(guò)程及其痛敏相關(guān)基因組學(xué)的觀察和研究仍較少。

細(xì)胞因子參與不同免疫細(xì)胞亞群的發(fā)育、成熟、分化、活化、效應(yīng)過(guò)程,能直接調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的過(guò)程。 基于Meso Scale Discovery(MSD)的微孔板電化學(xué)發(fā)光的多重免疫測(cè)定法是目前細(xì)胞因子檢測(cè)中靈敏度和準(zhǔn)確度最高的技術(shù),并可同時(shí)檢測(cè)疾病組織模型樣本中多種細(xì)胞因子的含量[14-15]。 RNA測(cè)序(RNA-sequencing,RNA-Seq)是近年來(lái)發(fā)展迅速的高通量測(cè)序技術(shù),具有分辨率高、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn),可從轉(zhuǎn)錄組水平揭示疾病模型的基因表達(dá)模式[16]。 本研究通過(guò)觀察股二頭肌CFA 注射后1～15 d 痛行為學(xué)、局部組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài)的變化,使用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)量局部組織和外周血中炎性因子含量,對(duì)CFA 肌肉炎性模型進(jìn)行系統(tǒng)的觀察;采用RNA-Seq 技術(shù)比較炎癥前期和炎癥后期局部肌肉中的基因表達(dá)變化,分析差異基因的功能,為在此模型上進(jìn)行的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供重要的參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用7 周齡清潔級(jí)Wistar 大鼠90 只,體重(209.47±4.86)g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2019-0010]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所[SYXK(京)2021-0017]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用指南》的要求,室溫在(24±1)℃,室溫維持照明12 h、黑暗12 h 交替的晝夜光照節(jié)律。 Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常組和CFA 注射后第1 天(MD1)、第3天(MD3)、第5 天(MD5)、第7 天(MD7)、第9 天(MD9)、第11 天(MD11)、第13 天(MD13)和第15天(MD15)模型組。 每組10 只大鼠,觀察各組大鼠左側(cè)足底的機(jī)械痛和熱痛閾值變化、各組大鼠隨機(jī)選擇其中8 只進(jìn)行局部組織和外周血中炎性因子表達(dá)水平的檢測(cè);從正常組、MD3 組和MD13 組大鼠中每組選取6 只,用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,2 只大鼠用于局部組織的形態(tài)學(xué)觀察。 全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(中科針倫D2018-04-13-1),實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

弗氏完全佐劑(貨號(hào):F5881,Sigma,美國(guó));異氟烷(寧芬,中國(guó));高效RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液(貨號(hào):R0010,索萊寶,中國(guó));10%福爾馬林固定液(貨號(hào):G2160,索萊寶,中國(guó));二甲苯(貨號(hào):CAS1330-20-7 國(guó)藥集團(tuán), 中國(guó)); V-PLEX Proinflammatory Panel 2 Rat Kit(貨號(hào):K153A0H,Meso Scale Discovery,美國(guó));TRIzol(貨號(hào):15596026,賽默飛,美國(guó))。

大(小)鼠熱輻射痛測(cè)定儀(Ugo Basile,意大利);動(dòng)態(tài)足底觸覺(jué)儀(Ugo Basile,意大利);大鼠呼吸麻醉機(jī)(瑞沃德,中國(guó));Thermo 4℃低溫高速離心機(jī)(Thermo,美國(guó));EG1150H 組織包埋機(jī)(徠卡,德國(guó));RM2235 石蠟切片機(jī)(徠卡,德國(guó));光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,日本);多因子檢測(cè)儀(Meso Scale Discovery,美國(guó));Agilent 2100(Agilent,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 炎性痛模型的建立

在異氟烷吸入麻醉下,將大鼠固定于俯臥位,對(duì)左側(cè)后肢進(jìn)行備皮。 在左側(cè)股二頭肌肌腹注入200 μL 的CFA,注射深度約0.5 cm,注射時(shí)間大于30 s,緩慢出針?lè)乐顾幰簼B漏。

1.3.2 足底機(jī)械痛閾和熱痛閾的測(cè)量

測(cè)試前將大鼠放入玻璃板面上的圍箱,適應(yīng)環(huán)境30 min。 測(cè)機(jī)械痛閾時(shí),勻速上升的金屬探針穿過(guò)網(wǎng)眼垂直刺激大鼠左、右側(cè)足底,當(dāng)出現(xiàn)明顯縮腿反應(yīng)時(shí),計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)結(jié)束,記錄大鼠縮足潛伏期(paw withdraw latency,PWL)。 左、右側(cè)各測(cè)3 次,每次間隔10 min,分別記錄雙側(cè)縮足潛伏期數(shù)值平均后為機(jī)械痛的縮足潛伏期。

測(cè)試前將大鼠放入玻璃板面上的圍箱內(nèi),適應(yīng)環(huán)境30 min,測(cè)熱痛閾時(shí),將紅外光源移至玻璃板下方,對(duì)準(zhǔn)大鼠左右側(cè)足底,按下紅外光發(fā)射器的按鈕,測(cè)試即開(kāi)始,直至大鼠感覺(jué)到疼痛,縮回后爪致使發(fā)熱反射突然下降并切斷紅外光源,計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)結(jié)束,此時(shí)記錄大鼠PWL。 左、右側(cè)各測(cè)3 次,每次間隔10 min,分別記錄雙側(cè)縮足潛伏期數(shù)值平均后為熱痛的縮足潛伏期。

1.3.3 局部肌肉組織石蠟切片的觀察

隨機(jī)選取正常組、MD3 組和MD13 組中2 只大鼠進(jìn)行灌流固定,取左側(cè)股骨頭至踝關(guān)節(jié)的肌肉組織,使用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,組織修塊后進(jìn)行石蠟包埋、切片并進(jìn)行HE 染色,染色完成后使用中性樹(shù)脂封片進(jìn)行觀察。

1.3.4 外周血及局部肌肉組織中炎性因子含量的測(cè)量

大鼠在異氟烷麻醉狀態(tài)下經(jīng)心臟采血,使用含抗EDTA 的采血管收集血液,然后將大鼠放入二氧化碳箱內(nèi)處死。 用12 mm 取皮器取炎癥部位的肌肉組織并放入液氮中冷凍,研磨稱量后置于-80℃冰箱保存。 收集到的血漿靜置15 min 后離心取上清液,而組織則加入10 倍質(zhì)量體積的高效RIPA 裂解液進(jìn)行裂解,提取蛋白。 根據(jù)說(shuō)明書(shū),使用VPLEX Pro-inflammatory Panel 2 Rat Kit 測(cè)量組織和血漿中炎性因子含量。 利用多因子檢測(cè)儀對(duì)樣本進(jìn)行分析,以量化電化學(xué)發(fā)光信號(hào),測(cè)定各細(xì)胞因子的濃度。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

隨機(jī)挑選正常組、MD3 組和MD13 組大鼠每組6 只,采集CFA 注射部位的肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。 TRIzol 法提取各組樣本總RNA,并在北京奧維森基因科技有限公司完成RNA 測(cè)序分析。 用Nanodrop 和Agilent 2100 分別檢測(cè)RNA 純度和完整性。 樣品檢測(cè)合格后,使用帶有Oligo(dT)的磁珠富集得到mRNA,再加入fragmentation buffer 將mRNA 打斷成短片段。 隨后,用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)以mRNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并進(jìn)行末端修復(fù)、加A、加接頭。 通過(guò)AMPure XP beads 對(duì)雙鏈cDNA 進(jìn)行片段大小選擇,最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以構(gòu)建cDNA 文庫(kù)。

建好的文庫(kù)先進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢,質(zhì)檢合格的文庫(kù)使用Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái),采用PE150 測(cè)序策略。 對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)Raw reads 質(zhì)控后,獲得Clean reads。 分別利用star 和Cufflinks 軟件完成比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本拼接分析,然后對(duì)所有基因進(jìn)行定量分析。 獲得基因表達(dá)量后,使用DESeq 進(jìn)行差異表達(dá)分析,以Q value ＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn),篩選出MD3 組和MD13 組大鼠與正常組之間顯著差異表達(dá)的基因。利用GOseq 軟件對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology) 功能及利用KOBAS 軟件進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,幫助了解差異表達(dá)基因的功能。 將得到的差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件,進(jìn)行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。 計(jì)算每個(gè)基因的連通性連接程度,即其連接的基因數(shù)量,以評(píng)估其在該網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)表示。 符合正態(tài)分布且方差齊者,采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);不滿足方差齊性或正態(tài)分布則采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn),以P＜0.05 作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。 配對(duì)樣本數(shù)據(jù)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),以P＜0.05 作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肌肉注射CFA 對(duì)大鼠患側(cè)足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的影響

CFA 肌肉注射1 d 后,模型組大鼠患側(cè)足底對(duì)于機(jī)械刺激的縮足潛伏期為(10.94±1.71)s,與正常組大鼠(23.69±4.21)s 相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 CFA 注射3、5、7、9、11、13和15 d 后大鼠機(jī)械痛縮足潛伏期分別為(9.57±2.88)s、(11.69±3.01)s、(9.70±3.48)s、(10.17±2.56)s、(8.98±2.10)s、(10.13±4.30)s 和(10.54±1.77)s,與正常組相比均顯著降低(P＜0.05)(見(jiàn)圖1A)。 在注射CFA 1 d 后,模型組大鼠對(duì)熱刺激的縮足潛伏期為(9.54±2.15)s,與正常組大鼠(17.03±3.81)s 相比明顯降低,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 CFA 注射3、5、7、9、11、13 和15 d 后大鼠熱痛縮足潛伏期分別為(8.65±2.01)s、(9.07±1.19)s、(7.89±1.96)s、(7.47±0.94)s、(7.27±1.28)s、(7.52±1.7)s 和(6.09±0.76)s,與正常組相比均顯著降低(P＜0.05)(見(jiàn)圖1B)。 說(shuō)明肌肉注射CFA 造成的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)大鼠同側(cè)足底產(chǎn)生持續(xù)的機(jī)械和熱痛敏。

圖1 肌肉注射CFA 對(duì)大鼠足底機(jī)械和熱痛閾的影響(±sxˉ,n=10)Note. A, Changes of PWL for mechanical stimulation. B, Changes of PWL for heat stimulation.Compared with control group, *P＜0.05.Figure 1 Effects of plantar mechanical and thermal pain thresholds in rats after injection of CFA in muscle

2.2 肌肉注射CFA 對(duì)大鼠局部組織中細(xì)胞因子含量的影響

CFA 肌肉注射1 d 后,模型組大鼠局部組織中IL-6、IL-1β 含量分別為(103.76±29.69) ng/mg、(9615.42±3941.95)pg/mg,與正常組大鼠(4.51±1.00)ng/mg、(269.81±96.07)pg/mg 相比明顯升高,具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 造模后不同時(shí)間大鼠局部肌肉組織中IL-6、IL-1β 均高于正常組(P＜0.05),其中CFA 肌肉注射13 d 后,模型組大鼠局部組織中IL-6、IL-1β 含量分別為(36.76±22.54)ng/mg、(5134.07±2955.51)pg/mg,與正常組大鼠相比均明顯升高,具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(圖2A、2B)。 CFA 肌肉注射1 d 后,模型組大鼠局部組織中TNF-α 含量為(644.33±208.81)pg/mg,與正常組大鼠(52.71±11.41)pg/mg 相比明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 造模后不同時(shí)間大鼠局部肌肉組織中TNF-α 均高于正常組(P＜0.05),其中CFA 肌肉注射13 d 后,模型組大鼠局部組織中TNF-α 含量達(dá)到最高值(1110.99±541.99)pg/mg,與正常組大鼠相比明顯升高,具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)(圖2C)。 造模后第1天組大鼠局部組織中抗炎因子IL-10 含量為(90.60±13.19)pg/mg,與正常組大鼠(141.35±41.42)pg/mg 相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模后不同時(shí)間大鼠局部肌肉組織中抗炎因子IL-10 含量均明顯低于正常組大鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2D)。 提示肌肉注射CFA 后,注射局部的肌肉組織分別在注射后第1～3 天和第13 天發(fā)生兩次明顯的炎性反應(yīng)。

圖2 CFA 注射對(duì)大鼠局部組織中炎性因子含量的影響(±s,n=8)Note. Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 Effect of CFA injection on the inflammatory factors levels in the local tissues of rats

2.3 肌肉注射CFA 對(duì)大鼠外周血中細(xì)胞因子含量的影響

CFA 肌肉注射1 d 后,模型組大鼠外周血中IL-6、IL-1β 含量分別為(570.45 ± 225.86) pg/mL、(14.30 ± 3.40) pg/mL,與正常組大鼠(83.20 ±22.92)pg/mL、(7.96±5.05)pg/mL 相比明顯升高,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 造模后不同時(shí)間大鼠局部外周血中IL-6、IL-1β 與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3A、3B)。 CFA 肌肉注射1 d后,模型組大鼠外周血中TNF-α 含量為(45.92±7.19)pg/mL,與正常組大鼠(26.65±2.63)pg/mL相比明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 造模后不同時(shí)間大鼠局部外周血中TNF-α 與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3C)。 而外周血中IL-10 的含量在局部肌肉注射CFA 后,隨著時(shí)間的變化逐漸降低。 在造模后的第7、9、11、13、15 d,外周血中IL-10 的含量分別為(7.04±1.86)pg/mL、(5.68±2.98)pg/mL、(6.10±2.96)pg/mL、(6.59±1.67)pg/mL、(5.07±0.92)pg/mL,與正常組大鼠(9.69±3.28)pg/mL 相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3D)。 提示肌肉注射CFA 后,在注射后第1 天可誘導(dǎo)發(fā)生全身性的炎性反應(yīng)。

圖3 CFA 注射對(duì)血漿中炎性因子含量的影響(±s,n=8)Note. Compared with control group, *P＜0.05.Figure 3 Effect of CFA injection on the inflammatory factors levels in plasma

2.4 CFA 注射后對(duì)炎癥局部組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)的影響

基于細(xì)胞因子的結(jié)果,我們選擇CFA 注射后第3天(去除CFA 注射后第1 天全身性炎性反應(yīng)對(duì)局部炎癥的影響)和第13 天的大鼠作為觀察對(duì)象,使用HE 染色方法對(duì)局部組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。正常組大鼠股二頭肌肌肉組織紋理清晰,結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。 造模后第3 天,可觀察到注射CFA 后肌肉組織被大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),并出現(xiàn)一定數(shù)量的膿性空泡和肉芽腫。 CFA 注射后第13 天,浸潤(rùn)在肌肉組織中的細(xì)胞種類主要為以淋巴細(xì)胞為主的單核細(xì)胞,及少量的中性粒細(xì)胞(圖4)。 通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的差異推測(cè)發(fā)生于CFA 注射后第3 天的炎性反應(yīng)是由固有免疫所介導(dǎo)的,而發(fā)生于CFA 注射后第13 天的炎性反應(yīng)是由適應(yīng)性免疫所介導(dǎo)的。

圖4 各組大鼠局部組織病理改變(HE 染色)Note. A, Control group. B, MD3 group. C, MD13 group. A1, B1, C1 is the enlarged diagram of the black block area in the A, B, C diagram respectively.Figure 4 Local histopathological changes in rats in each group (HE staining)

2.5 CFA 誘導(dǎo)大鼠肌肉炎癥中固有免疫和適應(yīng)性免疫基因表達(dá)的比較

為了進(jìn)一步比較CFA 誘導(dǎo)大鼠肌肉炎癥中固有免疫和適應(yīng)性免疫基因表達(dá)的差異,我們將取材于CFA 注射后第3 天和第13 天的組織樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。 首先為了證明實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性及評(píng)估結(jié)果的可靠性,我們對(duì)樣本間RNA 相關(guān)性進(jìn)行了分析。 由圖5A 可見(jiàn)組內(nèi)樣本之間的表達(dá)模式相似度高,差異性小,具有可重復(fù)性。 在轉(zhuǎn)錄組中,獲得基因表達(dá)量后,以Q value＜0.05 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異基因進(jìn)行篩選。 在MD3 組大鼠與MD13 組大鼠之間確定了5661 個(gè)差異表達(dá)基因,包括2950 個(gè)上調(diào)基因和2711 個(gè)下調(diào)基因。 繪制火山圖以展示差異顯著性基因的整體分布情況(圖5B)。

之后我們對(duì)差異基因集進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析,進(jìn)一步揭示差異表達(dá)基因所參與的生物學(xué)功能。 由圖可見(jiàn),與CFA 注射后第3 天的炎癥組織相比,第13 天的炎癥組織中上調(diào)基因GO 富集的生物過(guò)程主要有免疫系統(tǒng)對(duì)抗原刺激的防御反應(yīng)和處理過(guò)程、白細(xì)胞的激活等(圖5C)。KEGG 富集分析結(jié)果顯示差異基因參與了核糖體、細(xì)胞粘附分子、抗原加工和呈遞、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等(圖5D)。 說(shuō)明第13 天的炎癥組織中存在明顯的抗原呈遞、淋巴細(xì)胞分化并發(fā)揮效應(yīng)的現(xiàn)象,這與適應(yīng)性免疫的功能相符。

圖5 RNA-Seq 分析Note. A, RNA correlation analysis between samples. Value within the square represent the correlation coefficient R2between the two samples. The closer R2value is to 1, higher the similarity of expression patterns between the samples. B, Heatmap of differential expressed genes. Abscissa indicates the expression of multiple genes in different samples (log2 fold change) and the ordinate indicates the significance of the difference in expression (-log10 Padj). C, GO enrichment analysis. Biological process involved in upregulated differentially expressed genes in the MD13 group compared to the MD3 group. D, KEGG enrichment analysis.Figure5 RNA-Seqanalysis

2.6 CFA 注射誘導(dǎo)的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中與痛敏相關(guān)基因表達(dá)的差異

研究人員繼續(xù)對(duì)既往文獻(xiàn)中確認(rèn)炎性機(jī)械和熱痛敏相關(guān)Ccl3 基因[17-18],進(jìn)行蛋白質(zhì)互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。 在正常組與MD3 組和MD13 組相比的差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)圖中,分別鑒定出24 和30 個(gè)基因。 通過(guò)PPI 分析得到主要樞紐基因包括Ccl3、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10 等(圖6A、6B)。 利用上述基因定量分析所獲得的FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)值,繪制熱圖以展示目的基因在各組的表達(dá)水平(圖6C)。 由圖可見(jiàn)CFA 注射后上述基因的表達(dá)水平均高于正常組大鼠。 其中與MD3 組大鼠相比,MD13 組大鼠局部組織中Cxcl9、Cxcl10 基因的表達(dá)水平明顯升高,而Ccl3、Cxcl1 和Cxcl2 基因表達(dá)水平明顯降低(圖6D)。 固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中與痛敏相關(guān)基因表達(dá)的差異,說(shuō)明不同的免疫應(yīng)答通過(guò)調(diào)節(jié)不同的趨化因子基因表達(dá)對(duì)疼痛的敏化發(fā)揮作用。

圖6 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析與聚類熱圖Note. A, PPI network analysis of the Ccl3-related in the MD3 group. B, PPI network analysis of the Ccl3-related in the MD13 group. Larger volume indicates more gene junction points. C, High expression is shown in red, while low expression is shown in blue. D, Compared with the MD3 group,*P＜0.05. **P＜0.01.Figure 6 PPI network analysis and heatmap

3 討論

本研究觀察到肌肉注射CFA 可引起足底持續(xù)性的機(jī)械和熱痛敏,造成局部組織明顯的炎性反應(yīng)。 其具體表現(xiàn)為外周血和炎癥組織中IL-6、IL-1β和TNF-α 的水平在注射后24 h 顯著升高,局部組織中此類促炎因子在注射后第13 天再次升高,說(shuō)明在這兩個(gè)時(shí)間均出現(xiàn)了明顯的免疫反應(yīng)[19]。 我們通過(guò)觀察浸潤(rùn)在炎癥組織中的細(xì)胞形態(tài)差異推測(cè)CFA 注射后第3 天的炎性反應(yīng)是由固有免疫所介導(dǎo)的,而發(fā)生于注射后第13 天的炎性反應(yīng)是由適應(yīng)性免疫所介導(dǎo)的。 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,觀察到相對(duì)于注射后第13 天,在CFA 注射后第3 天局部組織中與免疫反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因上調(diào)并增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的處理和反應(yīng),其中涉及到Th 細(xì)胞的分化、細(xì)胞因子受體相互作用等重要生物學(xué)通路。 CFA 注射后局部組織中痛敏相關(guān)基因的表達(dá)水平升高,包括Ccl3、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10 等基因。

在CFA 所誘導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)中,外周血和炎癥組織中促炎因子主要由聚集到損傷部位的中性粒細(xì)胞所釋放。 前哨白細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)與病原體接觸時(shí)表面toll 樣受體識(shí)別并激活,從而產(chǎn)生炎性介質(zhì),包括血管活性物質(zhì)(如組胺、5-羥色胺)和趨化因子[19]。 組織駐留和招募的免疫細(xì)胞在炎癥局部分泌大量炎癥介質(zhì)(如IL-6、IL-1β、TNF-α),與傷害性感受神經(jīng)末梢上相應(yīng)的受體結(jié)合,激發(fā)傷害性感受神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓徒档蛣?dòng)作電位閾值,導(dǎo)致疼痛敏感性或“痛覺(jué)過(guò)敏”[20]。 有研究表明足底內(nèi)注射CFA 可明顯降低后足對(duì)機(jī)械刺激和熱刺激的痛閾值(3 h),同時(shí)炎癥足中TNF-α、IL-1β 和NGF 水平顯著升高。 在注射CFA 前1 h,足底注射抗TNF-α 血清能顯著延遲炎癥性痛覺(jué)過(guò)敏[21]。 隨后激活的中性粒細(xì)胞釋放出顆粒蛋白,促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞向炎癥病灶的募集與浸潤(rùn)[22],共同發(fā)揮以中性粒細(xì)胞為主導(dǎo)的吞噬、殺菌作用,來(lái)限制損傷或感染的范圍,完成固有免疫反應(yīng)[23]。 隨著中性粒細(xì)胞的吞噬凋亡以及膿皰的形成[24],巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡中性粒細(xì)胞的攝取促進(jìn)脂質(zhì)蛋白的產(chǎn)生,進(jìn)而降低中性粒細(xì)胞活性,減少促炎趨化因子和細(xì)胞因子的合成[25]。 脂質(zhì)蛋白抑制中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位,防止白細(xì)胞的進(jìn)一步浸潤(rùn),并促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞遷移,增強(qiáng)對(duì)凋亡細(xì)胞的攝取和清除,從而促使炎癥的消退[26]。 這也解釋了本研究觀察到炎癥組織中IL-6、IL-1β 含量在注射CFA 24 h后逐漸降低的現(xiàn)象。 而組織中TNF-α 水平保持升高,則是因?yàn)檠装Y部位的TNF-α 主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞。

除了清除凋亡的中性粒細(xì)胞外,吞噬細(xì)胞(以及密切相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞)對(duì)病灶中的抗原進(jìn)行攝取、吞噬和處理后,遷移到引流淋巴結(jié)并發(fā)育成熟,將抗原成分呈遞給T 淋巴細(xì)胞[27]。 Th 細(xì)胞表面受體被DC 細(xì)胞以MHCⅡ類分子途徑遞呈的抗原性多肽激活,開(kāi)始增值分化產(chǎn)生相同的Th 效應(yīng)細(xì)胞[28-29],促進(jìn)適應(yīng)性免疫的發(fā)生。 本研究針對(duì) CFA誘導(dǎo)的肌肉炎性痛模型大鼠在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中基因表達(dá)水平的變化,對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能和 KEGG 富集分析。 研究結(jié)果表明,差異表達(dá)基因主要參與了Th 細(xì)胞分化、Rap1 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路和細(xì)胞因子受體相互作用等重要生物學(xué)通路。 隨著免疫應(yīng)答的進(jìn)展,Th1 細(xì)胞受趨化因子誘導(dǎo)遷移到外周炎癥部位,分泌細(xì)胞因子(主要為IL-2、IFN-γ 和LT),使巨噬細(xì)胞高度活化、吞噬作用增強(qiáng),并上調(diào)附近其他抗原呈遞細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)[6]。 NK 細(xì)胞作為天然免疫細(xì)胞,能夠通過(guò)釋放細(xì)胞毒蛋白殺死感染和惡性細(xì)胞,以及產(chǎn)生細(xì)胞因子(IFN-γ 和TNF-α)來(lái)終止炎癥[30]。 Th 細(xì)胞以特異性識(shí)別抗原,輔助NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞清除并吞噬被感染的細(xì)胞宿主,發(fā)揮細(xì)胞免疫反應(yīng)。 在炎癥后期組織中TNF-α 主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞和NK 細(xì)胞,而TNF-α 的釋放增加又可以誘導(dǎo)組織中IL-6、IL-1β 水平升高[21]。

在CFA 誘導(dǎo)的不同免疫反應(yīng)時(shí)期,免疫系統(tǒng)通過(guò)對(duì)調(diào)整基因的差異性表達(dá)來(lái)控制疼痛。 痛覺(jué)的感知依賴于傷害性信息從外周傷害性感受器神經(jīng)元到脊髓二級(jí)中間神經(jīng)元的有效傳遞。 其中脊髓背角是這些神經(jīng)元之間發(fā)生聯(lián)系的區(qū)域,對(duì)疼痛強(qiáng)度起著至關(guān)重要的控制作用[31]。 由于持續(xù)的炎性刺激使得傷害性感受器通過(guò)其中樞神經(jīng)末梢表達(dá)和釋放炎癥介質(zhì)到脊髓,包括三磷酸腺苷、降鈣素基因相關(guān)肽和集落刺激因子1 等。 這些介質(zhì)激活了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞,使其產(chǎn)生炎癥介質(zhì)(如TNF-α、IL-1β 和前列腺素E2),從而誘導(dǎo)初級(jí)痛覺(jué)感受器神經(jīng)元和二級(jí)疼痛介導(dǎo)的中間神經(jīng)元過(guò)度興奮(中樞敏化)[32]。 有研究觀察到紫杉醇誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)病變模型大鼠在后爪出現(xiàn)持久的機(jī)械痛和熱痛超敏反應(yīng),同時(shí)伴隨著脊髓背角中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,并在模型組大鼠的脊髓背角中鑒定出Ccl3 基因表達(dá)水平顯著增加[33]。 小膠質(zhì)細(xì)胞中Ccl3 基因的表達(dá)與紫杉醇誘導(dǎo)的機(jī)械性異常性疼痛有關(guān),鞘內(nèi)注射CCL3 中和抗體可顯著減輕大鼠機(jī)械性痛覺(jué)超敏[18]。 在本研究中通過(guò)差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)圖分析Ccl3 基因,得到參與CFA 誘導(dǎo)的炎性痛敏機(jī)制的趨化因子家族基因。 我們注意到趨化因子家族基因在CFA 誘導(dǎo)的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中表達(dá)水平有所差異,將會(huì)在下一步的研究工作中繼續(xù)關(guān)注。綜上所述CFA 的注射可有效刺激免疫反應(yīng)的發(fā)生,誘導(dǎo)炎性痛敏,其中趨化因子家族基因發(fā)揮了重要的作用。