HPLC法同時測定不同產地番紅花中4種化合物的含量*

尚嚴嚴，李東林

(阜陽職業技術學院，安徽 阜陽 236031)

番紅花(學名：CrocussativusL.)又名藏紅花、西紅花，以其干燥柱頭入藥，是亞洲西南部原生種，最早在希臘人工栽培。主要分布歐洲、地中海及中亞等地，是一種名貴的中藥材[1-2]。明朝傳入我國，該藥具有散瘀止痛、活血化瘀，散濕去腫之功效，主要用于治經閉、痛經、胸脅刺痛、跌打損傷、瘡瘍腫痛等癥[3]。現代藥理研究表明，番紅花的特征性成分主要是西紅花苷、苦番紅花素、西紅花酸[4-5]。其中，西紅花苷具有抗氧化、降血壓、降血脂等作用；苦番紅花素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應激等作用；西紅花酸對心臟、保護海馬神經元等有保護作用[6-10]。然而因種植方法、種植區、氣候條件等不同，不同產地番紅花中藥效物質基礎存在一定的差異[11]。2020版《中國藥典》僅以西紅花苷和苦番紅花素為指標成分來評價番紅花藥材質量，相對單一的檢測指標對番紅花的質量評價存在一定的缺陷[12]。筆者此次收集了不同產區18批番紅花，結合《中國藥典》擬建立HPLC法測定番紅花中西紅花苷-I、西紅花苷-II、苦番紅花素、西紅花酸4種功效物質的含量，以期為番紅花在皖北合理“安家”提供定性、定量指標，為番紅花規范化生產提供科學依據。

1 材 料

1.1 儀器與試藥

安捷倫1260型高效液相色譜儀；十萬分之一天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；DL-60J智能臺式超聲波清洗機，上海之信儀器有限公司；西紅花苷-I(批號：P0187，純度≥98%)，上海純優生物科技有限公司;西紅花苷-II(批號：JW10503，純度≥98%)，上海極威生物科技有限公司;西紅花酸(批號：DX0041，純度≥98%)，成都德思特生物技術有限公司;苦番紅花素(批號：JOT-11341，純度≥98%)，成都普菲德生物技術有限公司；乙腈、甲醇色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 供試樣品

番紅花樣品購自安徽省阜陽市阜南縣番紅花種植專業合作社(編號：FN-1、FN-2、FN-3、FN-4、FN-5、FN-6)、安徽省亳州市譙城區番紅花種植戶(編號：BQ-1、BQ-2、BQ-3、BQ-4、BQ-5、BQ-6)和浙江建德(編號：ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3、ZJ-4、ZJ-5、ZJ-6)。18批番紅花樣品均經阜陽職業技術學院李東林教授鑒定為鳶尾科植物番紅花(CrocussativusL.)的干燥柱頭。

2 方 法

2.1 色譜條件

島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸)，流速1.0 mL/min；檢測波長為：250 nm、430 nm(0.00～15 min，430 nm；15.01～20.00，250 nm；20.01～50.00，430 nm)；柱溫為30 ℃，進樣量：10 μL，梯度洗脫。

表1 色譜條件

圖1 高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

取西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品適量，精密稱定，分別置100 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超聲(功率200 W，頻率40 kHz)10 min，提取2次，放置室溫，弱堿性乙醇定容，依次得濃度為518.1、326.4、181.36、590.4 μg/mL的母液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品(編號：FN-1)適量，打成細粉，過篩，稱取 20 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇50 mL溶解，冰浴超聲(功率200 W，頻率40 kHz)10 min，提取 2次，放置室溫，弱堿性乙醇定容，搖勻，濾過，即得續濾液。

2.4 線性范圍的考察

分別移取各母液各0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL，精密量取，分別置于10 mL量瓶中，加弱堿性稀乙醇溶液至刻度，搖勻，在“2.1”項色譜條件下測定。以西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品溶液的濃度為橫坐標 X，以峰面積為縱坐標 Y，繪制標準曲線。回歸方程及線性范圍見 表2所示。結果表明，4種化合物在各自濃度范圍內線性關系良好。

表2 線性關系考察

2.5 精密度試驗

2.5.1 不同日期精密度試驗

取同一對照品，在不同日期，在“2.1”項色譜條件下連續進樣 6 次，分別測得西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為 0.53%、0.77%、1.12%、0.68%，表明該方法的中間精密度良好。

2.5.2 不同儀器精密度試驗

取同一對照品，在不同儀器上，在“2.1”項色譜條件下連續進樣 6 次，分別測得西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為 0.65%、0.82%、1.23%、0.93%，表明該方法的中間精密度良好。

2.6 重復性試驗

取樣品(編號：FN-1)適量，稱取樣品20 mg，共6 份，精密稱定，按“2.3” 項下制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測定峰面積，計算西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素平均含量依次是：13.44%、5.81%、1.5%、8.69%；西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素RSD值分別為：1.15%、1.66%、2.19%、2.29%，說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取供試品(編號：FN-1)溶液，分別于 0、1、4、6、8、12、20 h 進樣，記錄峰面積，計算RSD值。結果顯示，西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素峰面積的RSD分別為1.19%、0.91%、0.87%、1.03%，表明供試品溶液室溫避光保存20h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的番紅花樣品(編號：FN-1)，稱取10 mg，共 6 份，精密稱定，置于100 mL量瓶中，分別加入西紅花苷-I、西紅花苷-II、西紅花酸、苦番紅花素對照品適量，按“2.3”項下制備供試品溶液，在色譜條件下測定，計算加樣回收率。4種化合物的平均加樣回收率及RSD值見表3所示。

表3 4種化合物的加樣回收率試驗(n=6)

2.9 樣品含量測定

取收集的18批番紅花樣品，分別稱取粉末約20 mg，精密稱定，按對應方法操作，制備番紅花供試品溶液，在色譜條件下測定，測定結果見表4所示。

表4 樣品含量測定結果(n =3)

續表4

3 結果與討論

3.1 提取方式考察

通過借鑒朱亞楠等[13]提取西紅花中有效成分的方法，并在此基礎之上進行優化，具體如下：因4種目標成分是在同一條件下提取，西紅花苷類物質中含有酯鍵，在溫度稍高、超聲時間稍長時，則已發生水解，致使目標成分含量減少，測量數據誤差增加；西紅花酸在2020版《中國藥典》條件下溶解性較差，可使其成鹽達到增加溶解度目的，使用弱堿性稀乙醇溶液則可事半功倍，故本次試驗在低溫、超聲10 min時，可以達到提取目標成分真實含量的目的。

3.2 色譜條件考察

通過對乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸溶液等多個流動相體系進行摸索比較[14-16]，乙腈-水作為流動相，西紅花酸與相鄰雜質峰之間分離度小于1.5，且乙腈價格較高毒性較大。甲醇-水作為流動相，基線不夠平穩，出峰時間較晚。故選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相，基線平穩，理論塔板數大于10231，四種成分的分離度大于2.5，峰形對稱性較好，可用于目標成分的分離與檢測。

3.3 結果分析

為便于直觀反映表4不同產地番紅花中4種有效物質的含量，采取繪制坐標圖的方式進行展示，見圖2。

圖2 不同產地番紅花中4種有效物質的含量

由圖2，對比不同產地番紅花中4種有效物質的含量，西紅花苷-I和苦番紅花素含量最高，其次為西紅花苷-II，最低為西紅花酸。其中，各批番紅花中西紅花苷-I和西紅花苷-II含量之和均超過18%、苦番紅花素的含量均超過8.0%，達到2020版《中國藥典》規定要求[12]。

阜南產番紅花(編號FN-1、FN-2、FN-3)中4種功效化合物含量稍低于其它產地，可能與采收的是一年生番紅花有關。此試驗排除不同生長年份對番紅花中有效物質含量的影響，阜南產(編號FN-4、FN-5、FN-6)藥材較少，故本次僅對安徽亳州和浙江建德產番紅花進行結果分析。

安徽亳州產番紅花中4種功效化合物的含量整體高于浙江建德。經多次實地考察，發現番紅花的品質受種植方式、土壤條件、田間肥力、溫濕度、降水量等的影響。

浙江建德采取室內外“二段式”種植模式，番紅花柱頭在室內采收后，種球于11月中下旬栽種于大田，室外生長6個月左右，次年5月地上部分干枯挖出種球，置陰涼通風處貯藏[17]。而安徽亳州采取室外“一段式”種植模式，即當年5月份種球不挖出，套種其它農作物遮陰使種球在地下渡過休眠期，開花期在田間采收柱頭。從采摘后的柱頭品相觀察，建德產番紅花優于亳州。但通過本實驗，結合前人研究[18]數據分析，亳州產番紅花中有效成分的含量高于浙江建德。結果表明，“一段式”和“二段式”種植模式對番紅花中有效成分的積累影響不大，且“二段式”生產成本較高，生產上要因地制宜，綜合考慮生長環境、品種、勞動力資源和經濟情況確定適宜生產模式。

從種植土壤環境分析，浙江建德土質黏重，板結不透氣；亳州土壤質地含砂量高，疏松透氣，不易積水。李明林等[19]研究表明，砂質土壤更適宜西紅花種球的生長，有利于營養成分的積累。

亳州產番紅花在種植過程中，多施用有機肥，有機肥中含有大量的有機物質和有益菌，能提供豐富的營養物質，有效改善土壤理化性質。

番紅花田間生長忌水澇，浙江建德地處亞熱帶季風氣候區，夏季降雨充沛，溫濕度較高，易致室外田間種球腐爛，室內采摘后的番紅花中有效成分含量下降；安徽亳州氣候處在暖溫帶南緣，氣候溫和，光照充足，雨量適中，有利于番紅花種球在大田生長。

除上述因素外，如病蟲害防治、鮮品加工方式、貯藏都會使番紅花有效成分含量發生變化，相關影響因子和效應還需要進一步深入研究，以期為番紅花在皖北地區規范化種植提供理論支撐。

此次試驗結果，發現西紅花酸的含量在不同產地之間差異不明顯，可能和本次試驗樣本量少有關，要使試驗結果更準確可靠，需要收集更多數量番紅花藥材樣本，測定番紅花中4種功效化合物的含量才更具有地域代表性。

4 結 論

本文采用HPLC法同時測定不同產地番紅花藥材中4種藥效化合物的含量，該方法簡便、穩定、重現性好，可用于番紅花的質量控制和評價。

目前，HPLC法測定番紅花中有效成分含量的研究多集中在不同產地之間的比較以及不同部位之間的比較[14，16，18]，而對其不同生長年份以及不同花期階段中化學成分含量變化關注較少，為提高番紅花的質量，應更加關注番紅花生長年限以及花期階段中化學成分含量的變化，為確定最佳采收時間提供依據。

通過本次試驗，可以進一步結合不同產地番紅花指紋圖譜的構建，來檢測番紅花中有效成分的種類與數量，從而更全面評價皖北地區番紅花的質量，最終為番紅花在皖北擴大生產規模，為全面促進鄉村振興和農戶創業增收奠定基礎。