山東新分布藥用植物碎米椏的DNA條形碼分子鑒定

葛俊偉, 李平, 張童童, 高飛, 王文越, 王鈞楠， 孫稚穎*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355; 2. 北京中醫藥大學，北京 102488)

為摸清中藥資源家底，確保我國中醫藥事業的可持續發展，從2011年起，全國各地陸續開展了第四次中藥資源普查工作[1]。本課題組在山東省滕州市野外進行資源普查的過程中，發現了一種野生唇形科植物。通過形態觀察，判斷其為香茶菜屬(Isodon(Schrad. ex Benth.) Spach)植物，并且該植物與有山東分布記錄的香茶菜屬內折香茶菜(Isodoninflexus(Thunb.) Kudo)較為相似，但也有差異，如雄蕊、花柱伸出，而內折香茶菜雄蕊、花柱內藏。進一步鑒定發現該植物與無山東分布記錄的碎米椏(I.rubescens(Hemsl.) Hara)更為相似。香茶菜屬為唇形科植物，木本或草本；根莖常肥大木質，葉具齒。聚傘花序，花具梗[2]。屬內多種植物入藥，如碎米椏，《中國藥典》收載，其干燥地上部分作冬凌草入藥，具有清熱解毒、活血止痛功效[3]，對多種癌癥的癥狀有緩解作用[4]。此外，內折香茶菜也有抗腫瘤作用[5]。在野外僅憑宏觀特征無法準確判斷該未知植物物種，因此有必要進行更深入的鑒定研究，從而為新資源的開發利用提供依據。

DNA條形碼技術能實現對中藥材方便快捷的鑒定。核ITS2序列與葉綠體psbA-trnH序列作為DNA條形碼現在被廣泛應用于藥用植物資源鑒定，并被收錄于2015版和2020版《中國藥典》第四部[6-7]，而且前人也做了大量研究，如psbA-trnH序列在薯蕷屬[8]、沉香屬[9]等中藥材的物種鑒定中的作用已得到證實，ITS2序列在板藍根[10]、白前[11]、烏頭屬[12]等中藥材的物種鑒定中同樣得到很好的應用。

因此，本研究將利用核基因組ITS2片段以及葉綠體基因組psbA-trnH基因間隔區作為DNA條形碼序列，對所調查物種進行分子鑒定，同時從GenBank下載相關可靠序列進行比對分析，旨在對所發現的這一野生植物進行準確的物種鑒定，進而為其資源開發利用等相關研究提供證據。

1 材料、試劑與方法

1.1 實驗材料

所研究植物樣品(wz)采自山東省滕州市濱湖鎮雙井村東南山坡，拍照觀察，經初步外部形態觀察后，單株取樣，隨機取3份不同植株個體幼嫩葉片(wz1，wz2，wz3)，硅膠干燥備用。憑證標本保存于山東中醫藥大學生藥系標本室(標本號為：370481181013001LY)。

1.2 試劑與儀器

試劑主要包括：GeneRed核酸染料；2×Taq PCR MasterMIX(含染料)；5×TBE Buffer；DL2000 marker；植物基因組DNA提取試劑盒(天根生物技術(北京)有限公司)等。

儀器主要包括：SYG-2恒溫水浴鍋(常州朗越儀器制造有限公司)；1-14高速離心機(德國SIGMA公司)；DYY-8B穩壓穩流電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；T100 Thermal Cycler熱循環儀(美國Bio-rad公司)；LUMINESCENT Amersham Imager 600圖像分析儀(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)；XFS-280CB手提式壓力蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫療器械有限公司)；303-OB電熱恒溫培養箱(紹興市滬越儀器設備廠)等。

1.3 方法

1.3.1 總DNA的提取

取干燥葉片約30 mg，于研缽內加液氮迅速研磨，用植物基因組DNA提取試劑盒參照說明書方法提取材料總DNA，，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 PCR擴增及測序

PCR擴增體系為25.0 μL：包括DNA模板2.0 μL，雙向引物各1.0 μL(濃度2.5 μmol/L)，2×Taq PCR MasterMIX12.5 μL，雙蒸水(約8.5 μL)補足至25 μL。PCR擴增反應條件及擴增實驗程序參考2015版、2020版《中國藥典》第四部等的研究方法[6-7,13]。PCR擴增產物經電泳檢測后，切膠純化，使用ABI 3730XL測序儀雙向測序。

PCR擴增及測序引物信息見表 1。

表1 引物信息Table 1 Information on primers

1.3.3 數據分析

所得序列利用軟件Chromasv校對拼接，對于核序列，切除兩端5.8S和28S堿基序列得到樣品的ITS2序列；對于葉綠體序列，切除兩端引物序列，得到psbA-trnH序列，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站進行Blast比對，并分別下載相關物種的ITS2和psbA-trnH序列，然后用軟件MEGA6.0進行數據分析，并利用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建距離樹[14-15]。

2 結果與分析

2.1 植物外部形態觀察

木質根；葉對生，卵圓形，先端漸尖，基部楔形，驟然漸狹下延，邊緣具鋸齒，葉膜質，上下表面被柔毛至近無毛；唇形花冠，紅至紫色，雄蕊4，伸出，花柱伸出；花盤環狀。

依據外部形態觀察，初步推斷所調查物種與內折香茶菜相似，與《中國植物志》英文版FloraofChina[2]中碎米椏形態更為吻合。

注：箭頭示主要鑒別特征。圖1 植物形態圖Fig.1 Morphology of the studied species

2.2 基因序列分析

2.2.1 ITS2序列

為了更好地確定該物種，從GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)下載了幾條碎米椏與內折香茶菜ITS2序列以作比較分析。通過分析發現，所測3株植物樣品ITS2堿基序列長度均為212 bp，GC含量為67.9%，3株植物個體堿基序列完全一致。與GenBank中所下載的碎米椏(Sequence ID:KF032250、KT285125、JQ389511、JQ389509)序列比對也無差異，與內折香茶菜(Sequence ID:KF032264、KF032265、KF032266)有7個位點差異，見表 2。同時經NCBI網站上Blast比對，本實驗所研究樣品與碎米椏的相似度為100%，構建系統聚類樹見圖2。可明顯看出，所研究樣品(wz1，wz2，wz3)與GenBank所下載碎米椏聚在一支。

表2 所研究植物樣品的ITS2差異位點信息Table 2 Information on different ITS2 loci in the studied samples

圖2 基于ITS2序列構建NJ距離樹Fig.2 Phylogenetic tree construction based on ITS2 sequences using the NJ method

2.2.2psbA-trnH序列

為了更好地鑒定該物種，從GenBank下載了內折香茶菜和碎米椏psbA-trnH序列，通過對實驗結果分析，所測3株不同個體樣品堿基序列長度均為391 bp，GC含量為29.7%，居群內個體間堿基序列無差異。與GenBank所下載序列比較，差異位點信息見表3。

表3 所研究植物樣品的psbA-trnH差異位點信息Table 3 Information on different psbA-trnH loci in the studied samples

其中KF855542兩端堿基序列不完整，根據Kimura 2-Parameter (K2P)遺傳距離分析得出，樣品與GenBank中提交的碎米椏(Sequence ID:FJ513119、KF855542)差異較小，遺傳距離為0.003～0.005；與內折香茶菜(Sequence ID:FJ513099、KF032288)差異較大，遺傳距離為0.026～0.027。利用鄰接法構建系統聚類樹見圖3，可以看出該研究物種與碎米椏聚在一支。

圖3 基于psbA-trnH序列構建NJ距離樹Fig.3 Phylogenetic tree construction based on psbA-trnH sequences using the NJ method

3 討論

本研究利用DNA條形碼技術對野外資源調查中所發現的形態鑒定不確定物種進行了分子鑒定，所采用的方法便捷、可靠，減少了客觀環境與主觀因素造成的誤差，保證了結果的準確性。DNA條形碼分別使用了核基因組ITS2序列與葉綠體基因組psbA-trnH序列。此外，從GenBank所下載作對比分析的序列均經過嚴格篩選溯源，保證其來源的準確性和可靠性，如KF855542來自中科院西雙版納植物園Yu等[16]發表在MolecularPhylogeneticsandEvolution上的文章，該文從系統發育學和生物地理學角度研究了香茶菜屬植物的快速輻射進化。JQ389511、JQ389509樣品采自中國河南省北部，論文發表在PLoSOne，作者采用系統發育學和居群遺傳學相結合的方式篩選中國香茶菜屬植物中冬凌草甲素含量豐富的物種資源，研究結果表明河南省所產碎米椏和毛葉香茶菜可以提供最好的冬凌草甲素來源[17]。KF032288、KF032250、KF032264、KF032265、KF032266來自夏至等[18]發表在《中草藥》上的文章，該文對碎米椏及其近緣種進行了分子鑒定，研究結果表明，碎米椏與毛葉香茶菜、香茶菜和內折香茶菜親緣關系較近，ITS和psbA-trnH 序列可以準確鑒別碎米椏及其近緣種。其余三條序列均來自Chen等[19]和向麗等[20]所提交序列。

通過DNA條形碼核基因組ITS2序列與葉綠體基因組psbA-trnH序列分析結果可以佐證作者野外形態觀察推論，判斷所研究樣品應該為碎米椏。本研究結果支持夏至等所發表文章觀點。但這兩種序列也有所差異，相比較而言，針對該物種，核基因組ITS2序列比葉綠體基因組psbA-trnH基因間隔區序列分辨力更高。差異主要是由于核基因來自雙親遺傳，而葉綠體基因是母系遺傳。

本實驗研究材料采自山東省滕州市，為全國第四次中藥資源普查中所發現，后在調查濟南市長清區中藥資源時，在靈巖山附近也有發現，根據實驗結果可知此香茶菜屬資源植物為碎米椏，而《山東植物志》《山東植物精要》《山東藥用植物志》等均沒有收載該物種[21-23]，也未見相關文獻報道其在山東有分布，因此認為碎米椏是山東境內新分布種。這一結論有助于補充和完善山東省的中藥資源數據庫，同時作為具有抗癌等多種活性的藥用植物資源，碎米椏在山東省的分布與發現，對該資源的開發和可持續利用具有重要意義。