基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金蕎麥抗呼吸道合胞病毒作用機(jī)制

杜海濤，王平，李娜，韓莉，丁潔，胡亞楠

(1. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；3.天津大學(xué) 精密測試技術(shù)及儀器國家重點實驗室，天津 300072)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染的主要原因，每年致55 000至199 000例兒童死亡[1-2]。由于感染后不會形成特異性免疫，患者愈后有再次感染的風(fēng)險[3-4]。目前尚無特異性藥物，疫苗研發(fā)進(jìn)程緩慢[5]。中藥在預(yù)防和治療病毒感染性疾病方面有著悠久歷史和豐富經(jīng)驗，通過作用于多層次的免疫功能，恢復(fù)機(jī)體環(huán)境的穩(wěn)定與平衡，在體內(nèi)外治療中均表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

金蕎麥為蓼科植物Fagopyrumdibotrys(D.Don) Hara的干燥根莖，又稱野蕎麥、金鎖銀開、赤地利等，歸肺經(jīng)，有清熱解毒之功效，主治肺熱咳喘、肺癰、咽喉腫痛等[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金蕎麥根莖中含有多種化合物，包括黃酮類、萜類、甾體及鞣質(zhì)等，多具有抗病毒、抗炎以及增強(qiáng)免疫等作用，但尚未闡明其藥理作用機(jī)制[7-8]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)分析等方法，探索生物實體之間潛在的作用關(guān)系[9-10]，其整體思路與中醫(yī)藥整體觀念相一致，可以應(yīng)用于解決中藥多成分、多靶點、協(xié)同作用等特點帶來的研究難題[11-12]。本研究在分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面對金蕎麥主要藥效成分進(jìn)行計算機(jī)虛擬篩選，探索中藥金蕎麥抗RSV的整體作用機(jī)制，以期初步揭示金蕎麥治療RSV肺炎的藥效基礎(chǔ)，為更好地開發(fā)抗病毒藥物提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究中采用的數(shù)據(jù)庫和分析軟件如下： TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Open Babel (http://openbabel.org/wiki/Main_Page)；SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards (http://www.genecards.org/)； PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)；GenCLiP 3 (http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)；NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；UniProt (http://www.uniprot.org/)； DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/)； KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)；STRING (https://string-db.org/)；Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)； GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)；R Studio (https://rstudio.com/)；RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)；PyMol 2.3.0(https://pymol.org/)； AutoDock Tools 1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)； Vina(http://vina.scripps.edu/)； Python 3.7(https://www.python.org/)。

1.2 金蕎麥化學(xué)成分的獲取及靶點預(yù)測

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)是一個用于中藥的系統(tǒng)級藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫，收納了藥典499種中草藥的化學(xué)成分、ADME參數(shù)等信息[13]。以“金蕎麥”為關(guān)鍵字，獲取TCMSP數(shù)據(jù)庫中該項下所有成分?jǐn)?shù)據(jù)，根據(jù)引文方法對其靶點進(jìn)行進(jìn)一步活性成分篩選[14]。將收集的化學(xué)成分逐一傳至Open Babel，將化合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為SMILES并導(dǎo)入到SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，將化合物與數(shù)據(jù)庫中靶點進(jìn)行模擬對接，選取結(jié)果Probability>0的靶點[15]。

1.3 金蕎麥作用靶點預(yù)測及RSV相關(guān)疾病靶點檢索分析

以“Respiratory Syncytial Virus”作為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫查找和GenCLiP 3、NCBI文獻(xiàn)檢索，獲取RSV感染后關(guān)聯(lián)靶點，刪除重復(fù)值建立RSV疾病靶點數(shù)據(jù)庫。將化合物成分及靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化，生成金蕎麥抗RSV成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network analyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)特征靶點。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及KEGG通路富集分析

使用STRING平臺獲取靶標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用( protein-protein interaction，PPI)關(guān)系[16]。將金蕎麥抗RSV潛在靶點蛋白名輸入設(shè)置隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)靶點，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，用Network analyzer 插件分析網(wǎng)絡(luò)特征靶點[17]，以節(jié)點度值(degree)評價節(jié)點的重要程度[18]。將網(wǎng)絡(luò)中大于2倍平均度值的節(jié)點定義為金蕎麥抗RSV的核心靶點[19]。

將RSV疾病靶點基因名用UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為Uniprot ID。在DAVID 6.8平臺對金蕎麥抗RSV核心靶點可能KEGG通路進(jìn)行富集分析，選擇差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)的條目，得到關(guān)鍵核心靶標(biāo)參與的通路信息。將核心蛋白UniProt ID 輸入KEGG平臺，得到每條通路的信息圖，整合后繪制金蕎麥核心靶點信號通路圖。

1.5 GEO芯片數(shù)據(jù)分析核心靶點

從GEO數(shù)據(jù)庫檢索并下載編號為GSE32138的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片收集了人氣道上皮細(xì)胞對RSV感染的反應(yīng)，包含4例經(jīng)RSV感染2 h后模型組和4例對照組細(xì)胞的測序信息[20]。使用Benjamini&Hochberg算法對P值進(jìn)行校正并篩選的差異基因[21]。使用R Studio將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，使用差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)繪制火山圖，篩選得到的核心靶點繪制熱圖。

1.6 分子對接

為了進(jìn)一步驗證篩選出的活性成分及核心靶點，將1.4項下金蕎麥核心靶點信號通路圖中的關(guān)鍵化合物與核心作用靶點及RSV結(jié)構(gòu)靶點進(jìn)行分子對接。從PBD數(shù)據(jù)庫下載靶蛋白的高分辨三維晶體結(jié)構(gòu)，使用PyMol 2.3.0 和Autodock Tools 1.5.6 進(jìn)行分子前處理，保存為*.pdbqt格式文件。運行Python及Autodock Vina 進(jìn)行批量半柔性分子對接，小分子輸出結(jié)果用PyMol2.3.0軟件可視化。

2 結(jié)果

2.1 金蕎麥活性成分及靶點預(yù)測結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出金蕎麥的相關(guān)成分61個，經(jīng)參數(shù)篩選出金蕎麥中15個潛在活性成分(表1)。通過 SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫獲得上述活性成分作用靶點209個；在平臺共檢索到RSV肺炎表型相關(guān)靶點共845個，整理合并得到金蕎麥體內(nèi)抗RSV潛在相互作用靶點45個。

表1 金蕎麥潛在活性成分Table 1 Potential active ingredients of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.2 構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的與RSV肺炎相關(guān)的靶點與成分建立關(guān)聯(lián)，導(dǎo)入Cytoscap3.7.1 中，合并成金蕎麥抗RSV成分-靶點相互作用關(guān)系，見圖1。該關(guān)系有205個節(jié)點，911條邊，可以看出同一靶點可對應(yīng)不同活性成分，不同活性成分也對應(yīng)多個靶點，充分體現(xiàn)了金蕎麥多成分、多靶點的作用特點。

圖1 金蕎麥抗RSV成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Anti-RSV ingredient-target network diagram of Fagopyri Dibotryis Rhizoma

2.3 PPI及KEGG通路富集分析結(jié)果

金蕎麥抗RSV的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2，該網(wǎng)絡(luò)有35個節(jié)點，97條邊，平均度值為5.543，大于2倍度值的AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR是該網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點。對金蕎麥15個化合物預(yù)測的靶點使用DAVID 6.8進(jìn)行KEGG通路富集分析(P<0.01)。富集得到金蕎麥抗RSV的30條主要通路，選取涉及抗病毒免疫的前6條通路將其結(jié)果可視化，可見金蕎麥抗病毒主要涉及VEGF信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路等，指示金蕎麥可能通過這些通路發(fā)揮抗RSV作用，如圖3 所示。

注：代表靶點度值由低到高。圖2 金蕎麥抗RSV的PPI網(wǎng)絡(luò) Fig.2 PPI network of Fagopyri Dibotryis Rhizoma against RSV

圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.3 Results of KEGG pathway enrichment analysis

將圖3的6條金蕎麥抗RSV相關(guān)通路進(jìn)行整合繪制主要靶點信號通路圖，由金蕎麥直接作用的靶點標(biāo)記為紅色(圖4)。提示金蕎麥抗RSV靶點主要分散于這幾條通路中，通過調(diào)節(jié)其中的幾個關(guān)鍵靶點發(fā)揮作用，且多數(shù)靶點在多條通路中發(fā)揮作用，如VEGF、AKT等。在核心靶點中未出現(xiàn)的BCL2、STAT3和KDR也有多條通路涉及，可能在通路間起調(diào)控樞紐的作用。將2.3項下得到的核心成分及涉及的靶點、通路匯總得到核心成分-基因靶點-信號通路圖(圖5)，該網(wǎng)絡(luò)有24個節(jié)點、73條邊。從網(wǎng)絡(luò)中可以看出，金蕎麥多個有效成分能夠作用于多個靶點，這些靶點進(jìn)一步調(diào)節(jié)核心信號通路，體現(xiàn)了金蕎麥多成分、多靶點整體調(diào)節(jié)的抗病毒作用機(jī)理。

圖4 核心靶點信號通路關(guān)聯(lián)圖Fig.4 Correlation diagram of core target signaling pathway

圖5 核心成分-靶點-信號通路圖Fig.5 Core ingredient-target-signaling pathway diagram

圖6 RSV感染相關(guān)芯片差異表達(dá)基因火山圖及差異表達(dá)基因的聚類熱圖Fig.6 Volcanic mapand cluster heatmap of differentially expressed genes related to RSV infection

2.4 候選靶點分析

對GEO芯片數(shù)據(jù)庫基因芯片的二次分析篩選獲得差異表達(dá)基因17 720個，篩選條件：P<0.01且Fold Change的絕對值>2，從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)金蕎麥抗RSV核心靶點全部屬于有意義的差異表達(dá)基因。以芯片中各個核心靶點上下調(diào)表達(dá)情況繪制聚類熱圖，使用綠色代表下調(diào)基因，紅色代表上調(diào)基因，可以看出對照組和模型組在各自的組內(nèi)能夠聚到一起，兩組之間具有明顯差異，該結(jié)果間接驗證了篩選出核心靶點的有效性。

2.5 分子對接

從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中共獲取了11個靶點蛋白，分別為RSV-G(6BLH)、RSV-F(5UDE)、RSV-L&P(6PZK)、SRC(2H8H)、PTGS2(5F19)、AKT1(1UNQ)、VEGFA(4ZFF)、EGFR(5WB7)、STAT1(3WWT)、KDR(3S35)與BCL2(5VAU)，其詳細(xì)信息見OSID。分子對接配體受體之間對接的結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性就越大，以結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol作為判定標(biāo)準(zhǔn)，小于此值說明配體具有潛在調(diào)節(jié)受體的活性。金蕎麥與靶點間的對接結(jié)合能見圖7，可以看出多數(shù)化合物與各靶點結(jié)合能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，原花青素B1(MOL000004)，β-谷甾醇(MOL000358)等與各靶點間結(jié)合能總和絕對值較高，初步驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。圖8列出了前4位核心成分與靶蛋白的結(jié)合位置(A1-H1)與3D對接細(xì)節(jié)(B2-H2)。分子對接結(jié)果說明金蕎麥核心成分可能主要依靠直接抑制病毒RNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄從而抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制增殖(RSV-L&P)，控制免疫進(jìn)程、細(xì)胞周期、凋亡、遷移(SRC)等過程發(fā)揮抗RSV作用。

注：單位kJ/mol。圖7 核心成分與靶點間的結(jié)合能熱圖Fig.7 Binding energy heatmap of core ingredients and targets

注：A為原花青素B1與RSV L&P蛋白，B為(-)-兒茶素沒食子酸酯與SRC，C為3,8-二羥基-10-甲氧基-5-h-異色烯[4,3-b]色烯-7-酮與SRC，D為β-谷甾醇與SRC，E為(-)-兒茶素沒食子酸酯與PTGS2，F(xiàn)為3,8-二羥基-10-甲氧基-5-h-異色烯[4,3-b]色烯-7-酮與PTGS2，G為原花青素B1與EGFR，H為β-谷甾醇與BCL2；3D關(guān)系中，藍(lán)色實線代表氫鍵相互作用，灰色虛線代表疏水相互作用，黃色虛線代表鹽橋，綠色虛線代表π-π垂直堆疊。圖8 關(guān)鍵成分靶點分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking pattern diagram of key ingredients and targets

3 討論

金蕎麥歸肺經(jīng)，為清熱解毒要藥，溫病名家吳鞠通指出“治上焦如羽，非輕不舉”，意在藥取辛涼，開已閉之肺，清解風(fēng)熱時邪。其主要成分黃酮、甾體、有機(jī)酸等具有抗多種病毒潛力。據(jù)核心成分-靶點-信號通路圖顯示，金蕎麥的多種成分可作用于多個靶點，最終通過多條通路起抗RSV作用。其中，黃酮占金蕎麥有效成分的33.3%，能夠直接作用于多個RSV結(jié)構(gòu)蛋白和體內(nèi)核心靶點。黃酮類組分能夠與病毒多個結(jié)構(gòu)蛋白直接結(jié)合，具有直接控制病毒復(fù)制的潛力，具有進(jìn)一步開發(fā)的價值[22]。因此，我們推測金蕎麥發(fā)揮抗RSV最主要的成分為黃酮類組分。

通過基因芯片結(jié)果的二次分析可以發(fā)現(xiàn)，氣道上皮細(xì)胞在RSV入侵后的2 h即可做出大量的應(yīng)答，差異表達(dá)基因高達(dá)17 720個，部分基因差異倍數(shù)較高。金蕎麥涉及的關(guān)鍵靶點上游基因均屬于差異基因，參與對病毒感染后體內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)。從PPI網(wǎng)絡(luò)可以看出，SRC、PTGS2、AKT1、VEGFA、EGFR五個靶點蛋白處于網(wǎng)絡(luò)中心，節(jié)點度值高，是金蕎麥體內(nèi)發(fā)揮抗病毒功效的核心靶點。KEGG靶點通路富集分析結(jié)果表明，金蕎麥體內(nèi)抗RSV涉及30條信號通路，多條與免疫、抗病毒直接相關(guān)，是一個復(fù)雜的過程。靶點通路分析結(jié)果顯示，BCL2、STAT3和KDR是重要的樞紐。即金蕎麥抗RSV的靶點主要涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、SRC、EGFR、KDR、STAT3、BCL2等。其中，SRC是一種酪氨酸的轉(zhuǎn)移性蛋白激酶，廣泛存在于各種細(xì)胞質(zhì)中，在病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用[23]。研究表明，SRC族激酶通過多種機(jī)制參與病原微生物的感染過程(如與病原微生物的脯氨酸基序-PXXP互作)[24]。鄭剛[25]發(fā)現(xiàn)SRC同源酶可促進(jìn)α-干擾素誘導(dǎo)的Jak/Stat1信號通路，從而抑制RSV復(fù)制。分子對接結(jié)果顯示SRC與金蕎麥各個核心成分結(jié)合力最強(qiáng)，推測是體內(nèi)通過免疫途徑發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵途徑。KDR是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的重要受體之一，結(jié)合后可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移、加速血管新生。有研究發(fā)現(xiàn)病毒侵染后，KDR導(dǎo)致特異性CD8+T細(xì)胞激活，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化，促使細(xì)胞增殖和膜通透性增加，可能是后期增強(qiáng)免疫的途徑之一[26]。STAT家族蛋白具有廣泛的生物學(xué)作用，抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、參與固有免疫反應(yīng)等。STAT在Jak-1和Tyk-2的催化作用下發(fā)生磷酸化, Jak-1和Jak-2刺激磷酸化的STAT形成二聚體，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活抗病毒啟動子，介導(dǎo)IFN途徑的免疫[27]。STAT1可通過乙?；?、泛素化、甲基化等不同修飾影響干擾素抑制病毒復(fù)制[28]。BCL2是線粒體介導(dǎo)的凋亡過程的關(guān)鍵信號因子。Kvansakul等[29]研究發(fā)現(xiàn)多種病毒通過調(diào)節(jié)BCL的同源物以阻斷宿主細(xì)胞的凋亡和自噬，防止感染細(xì)胞過早死亡。該研究提示可從調(diào)控細(xì)胞凋亡過程入手，阻止病毒在細(xì)胞中過度復(fù)制。PI3K和AKT參與維持RSV感染過程中細(xì)胞活力。PI3K及其下游介質(zhì)在氣道上皮細(xì)胞RSV感染過程中，在誘導(dǎo)凋亡和炎癥中起重要作用[30]。Monick等[31]研究證明，阻斷AKT活化會導(dǎo)致RSV感染的細(xì)胞加速凋亡。因此抑制PI3K和AKT過程可能是金蕎麥發(fā)揮抗RSV感染的途徑之一。EGFR可參與上皮細(xì)胞的生長、修復(fù)和瘤變, 在黏蛋白的分泌、細(xì)胞間緊密連接的調(diào)控中起重要作用，活化后可抑制氣道上皮細(xì)胞的抗病毒防御功能[32-33]。劉娟娟等[34]發(fā)現(xiàn)RSV可致EGFR活化，促進(jìn)IL-8釋放并抑制細(xì)胞凋亡，提示抑制EGFR的活化是降低RSV感染程度的方法。

綜上所述，金蕎麥抗RSV的15個潛在活性成分直接作用于45個體內(nèi)靶點與3個病毒結(jié)構(gòu)蛋白靶點，涉及多個基因、蛋白和通路，體現(xiàn)了金蕎麥多成分-多靶點-多途徑的作用特點，本文還對作用的主要途徑繪制了關(guān)鍵靶點通路簡圖，并通過GEO數(shù)據(jù)挖掘和分子對接初步驗證了核心靶標(biāo)在PPI 及通路中的樞紐作用，對金蕎麥抗病毒機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了方向，上述結(jié)果與文獻(xiàn)報道靶點基本一致。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能較好地體現(xiàn)大數(shù)據(jù)時代生物醫(yī)藥衛(wèi)生系統(tǒng)性研究的新方向與新趨勢，也能適應(yīng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化過程中對研究技術(shù)方法的迫切要求。隨著多組學(xué)以及高通量技術(shù)的發(fā)展，從整體角度出發(fā)，多層次手段挖掘、整合疾病的分子機(jī)制與藥物作用機(jī)制，必將會為金蕎麥的現(xiàn)代化開發(fā)和應(yīng)用提供新的思路。