基于網絡藥理學和分子對接探討貓爪草治療肺腺癌的作用機制

劉幸，黃紅麗，張樂，劉向芳，張文林，沈凌筠

(昆明市第三人民醫院 云南省傳染性疾病臨床醫學中心，云南 昆明 650041)

目前肺腺癌是我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，確診為各期肺腺癌后能夠存活10年的患者不到7%[2]，大約有四分之三的肺腺癌患者在確診后已經失去了手術的機會[3]。過晚的診斷以及有效個體化治療的缺失，需要我們更好地去了解治療肺腺癌藥物的作用機制，尋找有效靶向藥物。貓爪草為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb. 的干燥塊根[4]，具有散結、解毒、消腫之功[5]，含有多種生物活性成分，具有良好的抗結核、抗腫瘤等作用[6]。網絡藥理學通過融合系統生物學、生物信息學和網絡科學等學科，從系統層次和生物網絡的整體角度出發，分析藥物與治療對象之間的分子關聯，揭示藥物的系統性藥理機制[7]。本研究通過藥物-疾病相互作用關系構建藥物-靶點-疾病的多層次網絡，尋找貓爪草治療肺腺癌潛在的化學成分和作用靶點。利用網絡藥理學系統的研究方法，為貓爪草治療肺腺癌的臨床應用提供合理的科學依據。

1 材料與方法

1.1 貓爪草的活性成分篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集貓爪草的活性成分。設定TCMSP數據庫中的ADME屬性，以口服利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)作為篩選條件，其中OB≥30%、DL≥0.18[8]。

1.2 貓爪草活性成分的靶點預測

從TCMSP數據庫中提取貓爪草活性成分的靶點信息，利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶點信息進行注釋，篩選條件為“reviewed”，物種限定為人類。

1.3 肺腺癌相關基因的篩選

分別從GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數據庫(https://omim.org)中以“adenocarcinoma”為關鍵詞，挖掘治療肺腺癌的潛在靶點。刪除重復的疾病靶點及與疾病相關性評分較低的靶點(relevance score>4)，將兩個數據庫獲得的疾病靶點與貓爪草活性成分的靶點生成維恩圖。

1.4 藥物-成分-靶基因-疾病的網絡構建

去除貓爪草中無對應抗肺腺癌靶點的活性成分，將疾病、藥物、活性成分、靶點作為網絡圖中的節點，運用Cytoscape_v3.8.2軟件構建貓爪草活性成分-抗肺腺癌作用調控網絡及可視化。節點之間的連接代表生物分子間的相互作用。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建與分析

將貓爪草活性成分靶點與疾病靶點的交集靶點基因復制到STRING數據庫(https://string-db.org/)中分析，將物種設置為“Homo Sapiens”，在設置中點擊“hide disconnected nodes in the network”，更新去除離散的點，導出蛋白質-蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction，PPI)的TSV文件，利用R軟件的count包對文件進行分析，篩選核心基因。

1.6 分子對接驗證

在PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)中查詢核心基因的3D結構，使用AutoDockTools對靶點蛋白進行加氫、去水等處理，并對靶點蛋白和活性成分進行對接驗證，以親和能作為分子對接的結果。親和能<0代表靶點蛋白和活性成分能夠自發結合，親和能力強[9]。

1.7 核心基因在腫瘤組織中的表達

通過腫瘤免疫評估資源(tumor immune estimation resource, TIMER)數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中Diff Exp分析模塊，檢索與貓爪草活性成分結合能力最強的核心基因在腫瘤組織和正常組織中的表達差異。

1.8 GO與KEGG富集分析

通過UniProt數據庫對貓爪草抗肺腺癌靶點進行注釋，利用R軟件的ClusterProfilerba包和Pathway包進行基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號通路分析，限定物種為人類，以P<0.05表示具有顯著的富集作用，P值越小，富集程度越高。

2 結果

2.1 貓爪草的活性成分篩選

在TCMSP數據庫中，以OB≥30%且DL≥0.18為篩選條件，得到貓爪草的活性成分12個，作用靶點496個。其中有2個活性成分無對應靶點，故將其刪除，結果見表1。

表1 貓爪草活性成分Table 1 Active ingredients of Ranunculi Ternati Radix

2.2 貓爪草活性成分-抗肺腺癌靶點預測

從TCMSP數據庫中提取貓爪草的全部作用靶點基因，共計40個，見表2。在GeneCards數據庫和OMIM數據庫中檢索“adenocarcinoma ”，刪除重復的疾病靶點及與肺腺癌相關性評分低的靶點(relevance score>4)，共得到6 654個肺腺癌的靶點基因。將貓爪草的40個靶點基因和肺腺癌的6 654個靶點基因利用R軟件繪制維恩圖，獲得共同的交集靶點36個(圖1)，分別為CHRM1、SCN5A、SLC6A2、ADRA1B、SLC6A3、ADRB2、PGR、NR3C2、PTGS1、PTGS2、NCOA2、KCNH2、CHRM3、ADRA1A、CHRM2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、ADH1C、RXRA、NCOA1、ADRA2A、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。

表2 貓爪草的作用靶點Table 2 Targets of Ranunculi Ternati Radix

注：藍色代表肺腺癌靶點；黃色代表貓爪草靶點。圖1 肺腺癌-貓爪草交集靶點Fig.1 Intersection target of Ranunculi Ternati Radix in lung adenocarcinoma

2.3 藥物-成分-靶基因-疾病網絡構建

通過Cytoscape_v3.8.2軟件將貓爪草的10個活性成分與抗肺腺癌的36個作用靶點相連接，構建藥物-成分-靶基因-疾病網絡圖(圖2)。黃色橢圓形代表活性成分，紫色平行四邊形代表肺腺癌，紅色平行四邊形代表貓爪草，藍色三角形代表交集靶點。此圖由48個節點、170條邊構成，其中包含10個活性成分節點、36個作用靶點，充分體現貓爪草多成分、多靶點治療肺腺癌的作用特點。

圖2 貓爪草有效成分-靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of active ingredients and targets of Ranunculi Ternati Radix

2.4 PPI網絡構建與分析

將36個交集靶點復制到STRING數據庫，去除離散點，獲得PPI網絡圖(圖3)。包含36個節點，108條邊。圖中節點表示靶點，螺旋結構表示該基因的三維結構，邊表示靶點間的互作關系。使用R軟件對圖3中的連接點進行計數，得到靶點基因的count(節點計數)值，見表3。count值代表與此基因連接的節點數，數值越大表明在網絡中與該靶點基因互作的靶點基因越多。count值最高的4個靶點基因分別為ADRA1B、CASP3、JUN、MAOA。

圖3 PPI 網絡圖Fig.3 PPI network diagram

表3 靶點基因count值Table 3 Count value of target genes

2.5 分子對接驗證

將count值最高的4個靶點基因與與貓爪草的10個活性成分分別進行分子對接，對接的親和能值見表4。由表4可知，豆甾醇與ADRA1B、CASP3、MAOA的親和能值均最低，結合能力均較強；β-谷甾醇與JUN的親和能值最低，結合能力最強。結果表明，貓爪草的活性成分均可以對核心靶點基因發揮調控作用。選取CASP3結合能力最強的配體豆甾醇作圖，見圖4。

表4 靶點基因與活性成分親和能量表Table 4 Affinity energy between the target genes and active ingredients

圖4 CASP3與豆甾醇分子對接Fig.4 Molecular docking of CASP3 with stigmasterol

2.6 核心基因在腫瘤組織中的表達

如表4所示，count值最高的4個靶點基因中，平均親和能值最低的基因為CASP3，以CASP3作為核心基因在TIMER數據庫中檢索其表達情況，數據庫提供的33種腫瘤數據中，肺腺癌組織中CASP3 mRNA表達水平顯著高于正常組織(P<0.001)，還有14種腫瘤組織中KIF11 mRNA表達水平均高于正常組織(P<0.01)，分別為：膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤癌、膽管癌、結腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、肝細胞肝癌、肺鱗癌、直腸腺癌、胃腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌，如圖5所示。

注：*為<0.05；**為<0.01；***為<0.001。TPM(transcripts per million)為每百萬轉錄本。圖5 腫瘤組織中CASP3 mRNA的表達Fig.5 Expression of CASP3 mRNA in the tumor tissue

2.7 基因功能與信號通路分析

2.7.1 GO功能富集分析

將36個交集靶點進行GO功能富集分析，獲得67條GO條目，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的GO條目進行分析，并進行可視化展示(圖6)。結果表明，這些靶點主要與G蛋白偶聯胺受體活性、蛋白質異源二聚體活性、G蛋白偶聯的神經遞質受體活性、突觸后神經遞質受體活性、神經遞質受體活性等生物過程有關。

圖6 GO分析圖Fig.6 GO analysis chart

2.7.2 KEGG信號通路分析

將獲得的36個交集靶點進行KEGG信號通路富集分析，獲得68條信號通路，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的信號通路進行分析，并進行可視化展示(圖7)。結果顯示，貓爪草抗肺腺癌機制主要涉及神經變性的途徑-多種疾病、神經活性配體-受體相互作用、脂質和動脈粥樣硬化、鈣信號傳導途徑、血清素神經突觸、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導等通路，提示貓爪草抗肺腺癌可以通過多條信號通路發揮作用。

圖7 KEGG信號通路Fig.7 KEGG signaling pathway

3 討論

對貓爪草的藥理研究發現，其多糖、皂苷、醇、酯和脂肪酸具有重要的抗腫瘤作用[10]。其中貓爪草活性成分總皂苷(total saponins，TSRT)可通過下調semaphorin 4D(Sema4D)的表達，抑制人非小細胞肺腺癌(NSCLC)A549的增殖[11]。對貓爪草多糖的研究也證明，200 μg/mL貓爪草多糖可顯著提高巨噬細胞ANA-1細胞的增殖能力，其升高白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達，顯示出較強的抗腫瘤作用[12]。上述研究表明，貓爪草及其有效成分具有顯著的抗腫瘤作用。

本研究篩選出貓爪草10個與肺腺癌相關的活性成分及其36個作用靶點，并對其進行GO功能分析和KEGG信號通路富集分析，發現貓爪草在治療乙型肝炎、糖尿病、腫瘤、神經系統疾病以及麻疹等多個方面都具有一定的藥理作用。

通過GO功能富集結果可以看出，評分較高的基因功能是G蛋白偶聯胺受體活性。G蛋白偶聯受體(GPCRs)是7種跨膜結構域受體，可啟動各種細胞反應并調節體內平衡[13]。GPCRs在多種腫瘤組織中高表達，積極參與腫瘤干細胞(CSCs)相關的信號傳導和功能，GPCR拮抗劑和單克隆抗體可用于損害CSCs功能，抑制腫瘤細胞的生長[14]。 同時富集結果還顯示，貓爪草活性成分參與了多種神經遞質受體活性及其他重要的生物學功能(如細胞凋亡)。腫瘤細胞表面存在多種類型的神經遞質受體[15]，研究表明這些神經遞質受體參與調控多種腫瘤細胞的發生發展過程[16]，可影響多種腫瘤的進程。

分析KEGG信號通路富集結果，有多條癌癥相關通路，例如小細胞肺腺癌、神經變性的途徑-多種疾病、細胞凋亡等。其中包含CHRM1、PTGS2、CHRM3、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8等多個靶點。這些靶點主要對應貓爪草植物甾醇類的2個活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)。實驗證明小鼠的腫瘤組織細胞在β-谷甾醇組中產生了壞死區域，且出現明顯的細胞凋亡。可看出β-谷甾醇具有抗腫瘤作用，作用機制可能和β-谷甾醇對血清中IL-6、IFN-γ和VEGF表達的調控相關[17]。通過MTT法和集落形成實驗觀察到豆甾醇能抑制胃癌細胞的生長，DAPI和annexin V/PI染色法顯示出豆甾醇的抗增殖作用是由于其誘導線粒體介導的細胞凋亡。BAX和BCL2的表達進一步證實了這一點[18]。這些研究表明貓爪草中的植物甾醇可能是其抗腫瘤的主要活性成分。

在本研究中顯示，肺腺癌組織中CASP3 mRNA表達水平顯著高于正常組織(P<0.001)。CASP3靶點基因的亞致死激活作用，在原癌基因誘導的基因組不穩定和致癌轉化中起著至關重要的促進作用[19]，CASP3靶點基因的多態性可能導致不良的細胞凋亡信號傳導，從而促進多種人類癌癥的發作，非小細胞肺腺癌的發生和發展或與CASP3靶點基因的多態性有關[20]。以上研究均為網絡藥理學的富集分析結果提供了科學的解釋。

我們通過對KEGG信號通路富集結果的探討，初步闡釋了貓爪草治療肺腺癌的作用機制，為進一步的實驗研究奠定了基礎，并為中藥貓爪草的開發和應用指明了方向。