基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討貓爪草治療肺腺癌的作用機(jī)制

劉幸，黃紅麗，張樂(lè)，劉向芳，張文林，沈凌筠

(昆明市第三人民醫(yī)院 云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041)

目前肺腺癌是我國(guó)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，確診為各期肺腺癌后能夠存活10年的患者不到7%[2]，大約有四分之三的肺腺癌患者在確診后已經(jīng)失去了手術(shù)的機(jī)會(huì)[3]。過(guò)晚的診斷以及有效個(gè)體化治療的缺失，需要我們更好地去了解治療肺腺癌藥物的作用機(jī)制，尋找有效靶向藥物。貓爪草為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb. 的干燥塊根[4]，具有散結(jié)、解毒、消腫之功[5]，含有多種生物活性成分，具有良好的抗結(jié)核、抗腫瘤等作用[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)融合系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科，從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，分析藥物與治療對(duì)象之間的分子關(guān)聯(lián)，揭示藥物的系統(tǒng)性藥理機(jī)制[7]。本研究通過(guò)藥物-疾病相互作用關(guān)系構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病的多層次網(wǎng)絡(luò)，尋找貓爪草治療肺腺癌潛在的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)的研究方法，為貓爪草治療肺腺癌的臨床應(yīng)用提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 貓爪草的活性成分篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集貓爪草的活性成分。設(shè)定TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的ADME屬性，以口服利用度(oral bioavailability，OB)和類(lèi)藥性(drug-likeness，DL)作為篩選條件，其中OB≥30%、DL≥0.18[8]。

1.2 貓爪草活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中提取貓爪草活性成分的靶點(diǎn)信息，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行注釋?zhuān)Y選條件為“reviewed”，物種限定為人類(lèi)。

1.3 肺腺癌相關(guān)基因的篩選

分別從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org)中以“adenocarcinoma”為關(guān)鍵詞，挖掘治療肺腺癌的潛在靶點(diǎn)。刪除重復(fù)的疾病靶點(diǎn)及與疾病相關(guān)性評(píng)分較低的靶點(diǎn)(relevance score>4)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的疾病靶點(diǎn)與貓爪草活性成分的靶點(diǎn)生成維恩圖。

1.4 藥物-成分-靶基因-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

去除貓爪草中無(wú)對(duì)應(yīng)抗肺腺癌靶點(diǎn)的活性成分，將疾病、藥物、活性成分、靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape_v3.8.2軟件構(gòu)建貓爪草活性成分-抗肺腺癌作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及可視化。節(jié)點(diǎn)之間的連接代表生物分子間的相互作用。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將貓爪草活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)基因復(fù)制到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中分析，將物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，在設(shè)置中點(diǎn)擊“hide disconnected nodes in the network”，更新去除離散的點(diǎn)，導(dǎo)出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)的TSV文件，利用R軟件的count包對(duì)文件進(jìn)行分析，篩選核心基因。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中查詢核心基因的3D結(jié)構(gòu)，使用AutoDockTools對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫、去水等處理，并對(duì)靶點(diǎn)蛋白和活性成分進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證，以親和能作為分子對(duì)接的結(jié)果。親和能<0代表靶點(diǎn)蛋白和活性成分能夠自發(fā)結(jié)合，親和能力強(qiáng)[9]。

1.7 核心基因在腫瘤組織中的表達(dá)

通過(guò)腫瘤免疫評(píng)估資源(tumor immune estimation resource, TIMER)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中Diff Exp分析模塊，檢索與貓爪草活性成分結(jié)合能力最強(qiáng)的核心基因在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異。

1.8 GO與KEGG富集分析

通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)貓爪草抗肺腺癌靶點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)肦軟件的ClusterProfilerba包和Pathway包進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號(hào)通路分析，限定物種為人類(lèi)，以P<0.05表示具有顯著的富集作用，P值越小，富集程度越高。

2 結(jié)果

2.1 貓爪草的活性成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選條件，得到貓爪草的活性成分12個(gè)，作用靶點(diǎn)496個(gè)。其中有2個(gè)活性成分無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，故將其刪除，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 貓爪草活性成分Table 1 Active ingredients of Ranunculi Ternati Radix

2.2 貓爪草活性成分-抗肺腺癌靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中提取貓爪草的全部作用靶點(diǎn)基因，共計(jì)40個(gè)，見(jiàn)表2。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“adenocarcinoma ”，刪除重復(fù)的疾病靶點(diǎn)及與肺腺癌相關(guān)性評(píng)分低的靶點(diǎn)(relevance score>4)，共得到6 654個(gè)肺腺癌的靶點(diǎn)基因。將貓爪草的40個(gè)靶點(diǎn)基因和肺腺癌的6 654個(gè)靶點(diǎn)基因利用R軟件繪制維恩圖，獲得共同的交集靶點(diǎn)36個(gè)(圖1)，分別為CHRM1、SCN5A、SLC6A2、ADRA1B、SLC6A3、ADRB2、PGR、NR3C2、PTGS1、PTGS2、NCOA2、KCNH2、CHRM3、ADRA1A、CHRM2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、ADH1C、RXRA、NCOA1、ADRA2A、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。

表2 貓爪草的作用靶點(diǎn)Table 2 Targets of Ranunculi Ternati Radix

注：藍(lán)色代表肺腺癌靶點(diǎn)；黃色代表貓爪草靶點(diǎn)。圖1 肺腺癌-貓爪草交集靶點(diǎn)Fig.1 Intersection target of Ranunculi Ternati Radix in lung adenocarcinoma

2.3 藥物-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape_v3.8.2軟件將貓爪草的10個(gè)活性成分與抗肺腺癌的36個(gè)作用靶點(diǎn)相連接，構(gòu)建藥物-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。黃色橢圓形代表活性成分，紫色平行四邊形代表肺腺癌，紅色平行四邊形代表貓爪草，藍(lán)色三角形代表交集靶點(diǎn)。此圖由48個(gè)節(jié)點(diǎn)、170條邊構(gòu)成，其中包含10個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、36個(gè)作用靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)貓爪草多成分、多靶點(diǎn)治療肺腺癌的作用特點(diǎn)。

圖2 貓爪草有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active ingredients and targets of Ranunculi Ternati Radix

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將36個(gè)交集靶點(diǎn)復(fù)制到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，去除離散點(diǎn)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。包含36個(gè)節(jié)點(diǎn)，108條邊。圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，螺旋結(jié)構(gòu)表示該基因的三維結(jié)構(gòu)，邊表示靶點(diǎn)間的互作關(guān)系。使用R軟件對(duì)圖3中的連接點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到靶點(diǎn)基因的count(節(jié)點(diǎn)計(jì)數(shù))值，見(jiàn)表3。count值代表與此基因連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)，數(shù)值越大表明在網(wǎng)絡(luò)中與該靶點(diǎn)基因互作的靶點(diǎn)基因越多。count值最高的4個(gè)靶點(diǎn)基因分別為ADRA1B、CASP3、JUN、MAOA。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

表3 靶點(diǎn)基因count值Table 3 Count value of target genes

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

將count值最高的4個(gè)靶點(diǎn)基因與與貓爪草的10個(gè)活性成分分別進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接的親和能值見(jiàn)表4。由表4可知，豆甾醇與ADRA1B、CASP3、MAOA的親和能值均最低，結(jié)合能力均較強(qiáng)；β-谷甾醇與JUN的親和能值最低，結(jié)合能力最強(qiáng)。結(jié)果表明，貓爪草的活性成分均可以對(duì)核心靶點(diǎn)基因發(fā)揮調(diào)控作用。選取CASP3結(jié)合能力最強(qiáng)的配體豆甾醇作圖，見(jiàn)圖4。

表4 靶點(diǎn)基因與活性成分親和能量表Table 4 Affinity energy between the target genes and active ingredients

圖4 CASP3與豆甾醇分子對(duì)接Fig.4 Molecular docking of CASP3 with stigmasterol

2.6 核心基因在腫瘤組織中的表達(dá)

如表4所示，count值最高的4個(gè)靶點(diǎn)基因中，平均親和能值最低的基因?yàn)镃ASP3，以CASP3作為核心基因在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其表達(dá)情況，數(shù)據(jù)庫(kù)提供的33種腫瘤數(shù)據(jù)中，肺腺癌組織中CASP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.001)，還有14種腫瘤組織中KIF11 mRNA表達(dá)水平均高于正常組織(P<0.01)，分別為：膀胱尿路上皮癌、乳腺浸潤(rùn)癌、膽管癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞肝癌、肺鱗癌、直腸腺癌、胃腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌，如圖5所示。

注：*為<0.05；**為<0.01；***為<0.001。TPM(transcripts per million)為每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本。圖5 腫瘤組織中CASP3 mRNA的表達(dá)Fig.5 Expression of CASP3 mRNA in the tumor tissue

2.7 基因功能與信號(hào)通路分析

2.7.1 GO功能富集分析

將36個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，獲得67條GO條目，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的GO條目進(jìn)行分析，并進(jìn)行可視化展示(圖6)。結(jié)果表明，這些靶點(diǎn)主要與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、蛋白質(zhì)異源二聚體活性、G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等生物過(guò)程有關(guān)。

圖6 GO分析圖Fig.6 GO analysis chart

2.7.2 KEGG信號(hào)通路分析

將獲得的36個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，獲得68條信號(hào)通路，校正P值(P<0.05)，取位于前20位的信號(hào)通路進(jìn)行分析，并進(jìn)行可視化展示(圖7)。結(jié)果顯示，貓爪草抗肺腺癌機(jī)制主要涉及神經(jīng)變性的途徑-多種疾病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑、血清素神經(jīng)突觸、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)等通路，提示貓爪草抗肺腺癌可以通過(guò)多條信號(hào)通路發(fā)揮作用。

圖7 KEGG信號(hào)通路Fig.7 KEGG signaling pathway

3 討論

對(duì)貓爪草的藥理研究發(fā)現(xiàn)，其多糖、皂苷、醇、酯和脂肪酸具有重要的抗腫瘤作用[10]。其中貓爪草活性成分總皂苷(total saponins，TSRT)可通過(guò)下調(diào)semaphorin 4D(Sema4D)的表達(dá)，抑制人非小細(xì)胞肺腺癌(NSCLC)A549的增殖[11]。對(duì)貓爪草多糖的研究也證明，200 μg/mL貓爪草多糖可顯著提高巨噬細(xì)胞ANA-1細(xì)胞的增殖能力，其升高白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達(dá)，顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤作用[12]。上述研究表明，貓爪草及其有效成分具有顯著的抗腫瘤作用。

本研究篩選出貓爪草10個(gè)與肺腺癌相關(guān)的活性成分及其36個(gè)作用靶點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行GO功能分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)貓爪草在治療乙型肝炎、糖尿病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及麻疹等多個(gè)方面都具有一定的藥理作用。

通過(guò)GO功能富集結(jié)果可以看出，評(píng)分較高的基因功能是G蛋白偶聯(lián)胺受體活性。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是7種跨膜結(jié)構(gòu)域受體，可啟動(dòng)各種細(xì)胞反應(yīng)并調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡[13]。GPCRs在多種腫瘤組織中高表達(dá)，積極參與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)和功能，GPCR拮抗劑和單克隆抗體可用于損害CSCs功能，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。 同時(shí)富集結(jié)果還顯示，貓爪草活性成分參與了多種神經(jīng)遞質(zhì)受體活性及其他重要的生物學(xué)功能(如細(xì)胞凋亡)。腫瘤細(xì)胞表面存在多種類(lèi)型的神經(jīng)遞質(zhì)受體[15]，研究表明這些神經(jīng)遞質(zhì)受體參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[16]，可影響多種腫瘤的進(jìn)程。

分析KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果，有多條癌癥相關(guān)通路，例如小細(xì)胞肺腺癌、神經(jīng)變性的途徑-多種疾病、細(xì)胞凋亡等。其中包含CHRM1、PTGS2、CHRM3、BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8等多個(gè)靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)主要對(duì)應(yīng)貓爪草植物甾醇類(lèi)的2個(gè)活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)。實(shí)驗(yàn)證明小鼠的腫瘤組織細(xì)胞在β-谷甾醇組中產(chǎn)生了壞死區(qū)域，且出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。可看出β-谷甾醇具有抗腫瘤作用，作用機(jī)制可能和β-谷甾醇對(duì)血清中IL-6、IFN-γ和VEGF表達(dá)的調(diào)控相關(guān)[17]。通過(guò)MTT法和集落形成實(shí)驗(yàn)觀察到豆甾醇能抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，DAPI和annexin V/PI染色法顯示出豆甾醇的抗增殖作用是由于其誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。BAX和BCL2的表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)[18]。這些研究表明貓爪草中的植物甾醇可能是其抗腫瘤的主要活性成分。

在本研究中顯示，肺腺癌組織中CASP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.001)。CASP3靶點(diǎn)基因的亞致死激活作用，在原癌基因誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定和致癌轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的促進(jìn)作用[19]，CASP3靶點(diǎn)基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致不良的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)多種人類(lèi)癌癥的發(fā)作，非小細(xì)胞肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展或與CASP3靶點(diǎn)基因的多態(tài)性有關(guān)[20]。以上研究均為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的富集分析結(jié)果提供了科學(xué)的解釋。

我們通過(guò)對(duì)KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果的探討，初步闡釋了貓爪草治療肺腺癌的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)，并為中藥貓爪草的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用指明了方向。