網絡藥理學結合分子對接技術探索滅幽湯治療幽門螺桿菌相關性胃炎的作用機制

凡丞，楊金蘭，王升

信陽市中心醫院，信陽 河南 464000

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）由Marshall 和Warren 在20 世紀80 年代首次從人胃黏膜中分離出來。近年來Hp 導致的我國人群感染率處在較高水平。慢性胃炎、胃潰瘍與Hp 感染關系密切。且Hp 引起的長期感染還可導致胃惡性腫瘤，其中包括胃癌和MALT 淋巴瘤［1］。Sugano 等［2］撰寫的報告中提出應將Hp 感染相關性胃炎作為一種獨立的疾病看待。對于Hp 的傳統根除治療方案為抗菌藥物聯合質子泵抑制劑，劣勢是副作用和日益凸顯的耐藥性。世界多地報道了Hp 對克拉霉素耐藥率大于15%［3-4］。質子泵抑制劑的長期使用會引起消化系統、微量元素流失和心肌梗死風險增加等不良反應［5-6］。另外，還會引起腎臟和血液系統不良反應［7-8］。因此，尋求副作用小、敏感度較高的治療方法十分必要。

近年來，國家大力扶持中醫藥產業，以整體觀和辨證論治為根本的治療理念具有獨特優勢，有望成為治療HP 相關性胃炎的新方案［9］。湖南中醫藥大學以蒲公英、黃芩、陳皮、青皮、白及、三七及烏賊骨為組分研制的滅幽湯在治療Hp 相關性胃炎的多項臨床研究［10-11］及動物試驗［12-13］中取得良好收效。但滅幽湯組分復雜，目前尚無針對滅幽湯治療HP 相關性胃炎的系統性研究，具體機制有待闡明。為此，本研究將采用網絡藥理學研究方法探究滅幽湯治療HP 相關性胃炎的作用機制，以期為后續試驗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 滅幽湯化學成分收集和活性成分的篩選

滅幽湯組方為蒲公英（20 g）、三七（6 g）、黃芩（15 g）、青皮（10 g）、陳皮（10 g）、白及（10 g）和烏賊骨（15 g），制備方法見文獻［12］。運用數據庫TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）及數據庫TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid）結合文獻搜集滅幽湯中各組分的化學成分，并賦予TCMSP 編號。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為標準對搜集的化學成分進行活性成分篩選。

1.2 活性成分靶點篩選

運用TCMSP 數據庫對活性成分進行靶點預測，并得到對應的靶蛋白全稱。以“Helicobacter pylori associated gastritics”為關鍵詞檢索Genecards 數據庫（http://www.genecards.org/）得到疾病相關基因。以“Homo Sapiens”為篩選標準，經Uniprot 數據庫（http://www.uniprot.org/）將藥物靶點和疾病靶點對應的靶蛋白全稱進行標準化命名。通過取交集，獲得活性成分與疾病共有靶點。運用Cytoscape3.7.1軟件構建滅幽湯活性成分-靶點網絡模型，運用Network analyzer 工具分析活性成分degree 值，degree 值越高表明活性成分治療地位越重要。

1.3 靶點蛋白互作網絡的構建及核心靶點篩選

將滅幽湯活性成分與疾病共有靶點基因導入String 數據庫（http://www.string-db.org/），物種選擇人類，得到蛋白互作關系數據的TSV 格式文件。將文件導入Cytoscape 得到蛋白互作關系網絡，使用CytoNCA 插件篩選核心基因，并構建子網絡。進一步使用CytoHubba 插件中提供的最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法篩選TOP10核心基因。

1.4 分子對接

分別在PubChem 網站（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載活性成分和靶蛋白的3D 結構SDF 格式文件。使用Pymol 對原始蛋白進行去水去配體。Openbable 軟件將活性成分保存為“mol2”格式。然后Autodock tools 軟件對活性成分和蛋白進行加氫、電荷分配操作，保存為“PDBQT”格式文件。運用Autodock Vina 軟件對“活性成分-靶點網絡”中degree 值前5 位的活性成分和degree 值前15 位且屬于PPI 互作網絡中TOP10 蛋白的靶點進行分子對接，使用結合能評估活性成分與蛋白的結合活性，結合能越小，對接活性越強，復合物越穩定。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

將活性成分和疾病共有靶點輸入Metascape 網站（http://www.metascape.org/），物種選擇“H.Sapiens”，導出分析結果。收集GO 和KEGG 條目，以及與之對應的基因數量（count）、-Log（p）值，運用Excel 2010 繪制條形圖。

2 結果

2.1 滅幽湯的活性成分

共得78 種活性成分，其中蒲公英15 種，黃芩36 種，陳皮5 種，青皮5 種，三七8 種，白及9種，烏賊骨主要由鹽和氨基酸構成，本次未搜集到烏賊骨相關活性成分。共得到滅幽湯活性成分靶標1 226 種，去重及除去未匹配到的基因后得到205 種。Gene cards 數據庫中共得到疾病相關靶標871 種，與滅幽湯活性成分靶標取交集后得到共有靶標97 種，見圖1。剔除無關聯的活性成分，共得到作用于疾病的潛在活性成分62 種，其中蒲公英10 種，黃芩29 種，陳皮5 種，青皮5 種，三七7 種，白及6 種，見表1。62 種潛在活性成分與97 種“活性成分-疾病”共有靶標的相互作用網絡圖見圖2。

圖1 Hp相關性胃炎靶點與滅幽湯作用靶點的韋恩圖

圖2 滅幽湯“活性成分-潛在靶點”的網絡關系

表1 滅幽湯治療Hp相關性胃炎的潛在活性成分

2.2 蛋白互作網絡的構建

97 個活性成分與疾病共有靶點的初始蛋白互作網絡包含97 個節點和2 026 條邊。經CytoNCA插件對初始網絡中degree＞41 的節點構建子網絡。經CytoHubba 插件對子網絡進一步篩選得到核心基因網絡圖，核心基因為前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）、腫瘤蛋白P53（TP53）、絲/蘇氨酸蛋白激酶B1（AKT1）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAKP3）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、原癌基因（JUN）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）和白介素6（IL6）。見圖3。

圖3 滅幽湯治療Hp相關性胃炎的蛋白相互作用網絡

2.3 GO 與KEGG 富集分析

通過GO 功能富集分析，滅幽湯治療Hp 相關性胃炎與1 781 個生物過程、60 個細胞組成以及111個分子功能存在相關性（P＜0.01）。根據P 值選取前10 個GO 條目繪制條形圖，見圖4，圖5。KEGG富集分析共得到241 條信號通路，選取前20 個信號通路繪制條形圖，主要包括癌癥途徑、IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路和Hp 感染中的上皮細胞信號傳導通路，見圖6。

圖4 GO細胞元件富集分析

圖5 GO分子功能富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

2.4 活性成分與潛在靶點的分子對接

根據“1.4”中所示方法進行分子對接，結果顯示槲皮素、木樨草素、川陳皮素、柚皮素和β-谷甾醇分別與PTGS2、TP53、AKT1、CASP3 均具有較好的結合活性，結合能均大于-5 kcal/mol。且與PTGS2 結合活性最高，見表2。活性成分與靶點主要依靠氫鍵作用力結合，部分活性成分與靶蛋白的結合細節圖見圖7。

圖7 滅幽湯活性成分與核心靶點的分析對接圖

表2 滅幽湯關鍵活性成分與核心靶點的分子對接結果（kcal/mol）

3 討論

通過活性成分-靶點網絡圖可以看出滅幽湯中含活性成分最多的中藥依次為黃芩、蒲公英、三七、白及、陳皮和青皮。結合與靶標的連接情況來看，度值排名前5 位的活性成分中，共有成分槲皮素、柚皮素、川陳皮素和β-谷甾醇以及來源于蒲公英的木樨草素與靶標連接更密集。槲皮素為類黃酮化合物，結構中含大量酚羥基，具有抗炎、抗細胞氧化［14］、抑制HP［15］等活性。木樨草素也屬于類黃酮化合物，其在體內外抗炎活性均較強［16］，有研究表明木樨草素可通過改變Hp 感染胃癌CRL-1739 細胞ADAM-17、IL-8、IL-10 和NF-κB 的表達可能成為治療胃癌的潛在化合物［17］。川陳皮素可以誘導CD74 蛋白（幽門螺桿菌脲酶粘附蛋白分子）的表達，是一種抑制Hp 粘附和感染的候選化合物［18］。β-谷甾醇可通過介導AMPK、PTEN、和Hsp90 作用于胃腺癌細胞發揮抗癌作用［19］。本研究活性成分與疾病共有靶點97個，通過CytoNCA 和CytoHubba 插件提供的MCC 算法兩步篩選得到前10 位核心靶點，為PTGS2、TP53、AKT1、CASP3、MAKP3、VEGFA、JUN、MAPK8、MAPK1 和IL6。MCC 算法提供了較好的敏感度和特異度，更有利于精確發現關鍵節點［20］。提示以上十個靶點在蛋白互作網絡中處于關鍵地位。

有文獻表明，部分靶點在Hp 相關性胃炎形成和進展階段發揮關鍵作用。其中PTGS2 為環氧合酶，屬于誘導型酶，通常以較低活性存在于正常組織中，炎癥刺激可使其表達水平上調，經過生物化學反應，產生前列腺素［21］，最終引起炎性反應和疼痛。由此可見滅幽湯通過多種活性成分作用于PTGS2，這對治療Hp 相關性胃炎具有重要作用。JUN 編碼的是一種轉錄因子AP-1，Hp 可通過AP-1 刺激巨噬細胞，進而產生遞質促進炎癥發生［22］。IL-6 是一種促炎細胞因子，有研究顯示其與胃炎炎癥程度呈正相關［23］。

GO 富集分析顯示，活性成分-疾病共有靶點主要參與對脂多糖的反應、凋亡信號通路以及對氧化應激的反應等生物過程。基于KEGG 通路富集分析可知，IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路、Jak-STAT信號通路及Hp 感染中的上皮細胞信號傳導和癌癥途徑與胃炎密切相關。其中，NF-κB 信號通路可調節包括細胞因子和黏附分子等參與炎癥反應的蛋白的基因轉錄過程，在胃炎到胃癌的發展進程中有重要調節作用［24-25］。IL-17 是一種促炎細胞因子。據報道，Hp 感染患者胃黏膜IL-17 蛋白的表達水平上調，而在根除Hp 后，IL-17 蛋白表達水平隨之下降［26］。本研究中，蛋白互作網絡前10 位核心基因中PTGS2、IL-6 以及CASP3 皆分布在IL-17 信號通路圖中。JAK-STAT 信號通路是目前已知的三大炎癥信號通路之一，還具有調節細胞增殖、分化和凋亡等功能［27-28］。據報道，中草藥發揮抗Hp 作用主要集中在抗炎和抗癌相關的信號通路［29］，本研究結果顯示，前20 條信號通路中有諸多通路執行的是炎癥和癌癥路徑。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的研究方法得到了滅幽湯的主要活性成分有槲皮素、柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇和木樨草素。主要通過作用于PTGS2、JUN 和IL6 等關鍵靶點來調控IL-17 信號通路、NF-κB 信號通路、Jak-STAT 信號通路來治療幽門螺桿菌相關性胃炎。分子對接也初步證實degree值前五位的活性成分與PTGS2、TP53、AKT1 以及CASP3 有較好的結合活性，由此可見，滅幽湯中的活性成分可以通過作用于多個靶點來調控涉及炎癥、細胞增殖和凋亡相關的信號通路來治療幽門螺桿菌相關性胃炎。這對于進一步探究滅幽湯的作用機制以及發現治療相關的先導化合物具有前期借鑒價值。