二氧化硅納米顆粒致HUVEC內質網應激的機制

姜小軍， 薛盼盼， 陳舒婷， 高慧倩， 封少龍

(1.南華大學衡陽醫學院公共衛生學院，湖南省衡陽市 421001；2.桂林醫學院公共衛生學院預防醫學研究所，廣西壯族自治區桂林市 541199)

人工納米顆粒通過各種途徑暴露于人體，其潛在的健康危害受到了普遍關注，同時也是當前環境醫學研究的前沿領域[1-2]。二氧化硅納米顆粒(silica nanoparticles，SiNP)透過人體的多種生理屏障，進入血流，直接暴露于心血管系統，因此，其對心血管系統的潛在危害成了人們的重要關注點[1]。本課題組前期研究發現，SiNP可致人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)損傷與凋亡[1,3]，但其可能的分子機制尚不清楚。

現代醫學研究表明，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是內外環境因素導致細胞凋亡的重要途徑，也是心血管疾病發生發展的重要病理機制[4-6]。但SiNP是否可以誘導HUVEC的ERS和激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)尚不清楚。本文研究SiNP對HUVEC ERS的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

SiNP購于江蘇先豐納米公司；胎牛血清購于南美Gibco公司；DMEM高糖培養基購于美國Hyclone公司；青/鏈霉素(雙抗)、胰蛋白酶購于北京索萊寶公司；蛋白定量試劑盒購于康為世紀；β-actin抗體購于美國Proteintech公司；蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、磷酸化PERK(phosphorylated PERK，p-PERK)、肌醇需求激酶1α(inositol-requiring protein 1α，IRE1α)、磷酸化IRE1α(phosphorylated IRE1α，p-IRE1α)、激活轉錄因子-6(activating transcription factor-6，ATF-6)、剪切型X-盒結合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)、結合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein，Bip)、Calnexin、蛋白質二硫化物異構酶(protein disulfide isomerases，PDI)、真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphorylated eIF2α，p-eIF2α)、激活轉錄因子-4(activating transcription factor-4，ATF-4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、磷酸化CHOP(phosphorylated CHOP，p-CHOP)、細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)、內質網氧化還原蛋白1-Lα(endoplasmic reticulum oxidoreductin1-Lα，Ero1-Lα)、c-Jun氨基末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase1/2，JNK1/2)，磷酸化JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養

HUVEC由南華大學心血管疾病研究所提供。HUVEC在含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素混合液和1% HEPES的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于后續試驗。

1.3 免疫熒光檢測

不同質量濃度(0、25、50、100 mg/L)SiNP處理HUVEC細胞24 h后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次。0.4% TritonX-100處置20 min，PBS清洗2次，山羊血清工作液室溫封閉20 min。抗目標蛋白的一抗孵育，于4 ℃冰箱過夜，PBS清洗2次。FITC標記的二抗避光室溫孵育1 h，PBS清洗2次。DAPI避光孵育15 min，PBS清洗，熒光顯微鏡觀察，并采集圖片。

1.4 Western blotting

不同質量濃度(0、25、50、100 mg/L)SiNP處理HUVEC細胞24 h后，細胞裂解液冰上裂解細胞，收集蛋白，用于后續實驗。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至PVDF膜上。經5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，把膜與抗目的蛋白的一抗4 ℃孵育過夜。次日，膜經TBST洗3次后，與相應的二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜3次。采用ECL發光液于化學發光凝膠成像分析系統(美國，Azure)顯影成像。Image-J圖像分析軟件進行灰度值分析。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 SiNP誘導HUVEC內質網應激

與0 mg/L SiNP組比較，50、100 mg/L SiNP組PDI和100 mg/L SiNP組PERK蛋白及其磷酸化水平升高，而25、50、100 mg/L SiNP組的Bip、Calnexin、eIF2α蛋白及其磷酸化水平均升高且呈劑量-效應關系(P<0.01；圖1、圖2)。SiNP能誘導HUVEC的ERS。

圖1 SiNP對HUVEC中Bip、Calnexin和PDI蛋白表達的影響A為Bip、Calnexin和PDI的蛋白條帶；B為Bip、Calnexin和PDI蛋白表達水平柱狀圖。a為P<0.01，與0 mg/L SiNP組比較。

圖2 SiNP對UPR中PERK eIF2α通路蛋白表達的影響A為目標蛋白的條帶；B為PERK、eIF2α的磷酸化水平柱狀圖。a為P<0.01，與0 mg/L SiNP組比較。

2.2 SiNP誘導細胞內質網應激下游基因的表達

SiNP顯著性增加下游標志性基因蛋白ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的表達，并呈劑量-效應關系(P<0.01；圖3)。細胞免疫熒光結果顯示，ATF-4可進入細胞核，促進下游基因p-CHOP和Cyt C的表達(圖3)。

圖3 SiNP誘導細胞內質網應激下游基因的表達A為ATF-4的表達與細胞定位(熒光染色，200×)；B為ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的蛋白條帶；C為ATF-4、p-CHOP、Ero1-Lα、Cyt C蛋白表達水平柱狀圖。a為P<0.01，與0 mg/L SiNP組比較。

2.3 SiNP激活UPR中IRE1α通路

與0 mg/L SiNP組比較，50、100 mg/L SiNP組JNK磷酸化水平升高，而25、50、100 mg/L SiNP組IRE1α、XBP1s蛋白及磷酸化水平升高且呈劑量-效應關系(P<0.01；圖4)。即SiNP可激活HUVEC的IRE1α通路。

圖4 SiNP激活UPR中IRE1α通路A為IRE1α通路相關蛋白的條帶；B為IRE1α通路相關蛋白表達與磷酸化水平柱狀圖。a為P<0.01，與0 mg/L SiNP組比較。

2.4 SiNP激活UPR中ATF-6通路

SiNP顯著上調ATF-6的表達且呈現劑量-效應關系(P<0.01；圖5)，即SiNP激活URP反應中的ATF-6通路。

圖5 SiNP激活UPR中ATF-6通路A為ATF-6的表達與細胞定位(熒光染色200×)；B為ATF-6蛋白條帶；C為ATF-6的相對表達柱狀圖。a為P<0.01，與0 mg/L SiNP組比較

3 討 論

本文結果表明，SiNP可以誘導HUVEC內ERS的生物標志物Bip和Calnexin的表達上調，激活UPR的負反饋調節通路PERK通路，并促進ERS的3個經典途徑ATF-4、IRE1α和ATF-6通路及其下游關鍵基因蛋白CHOP、Ero1-Lα、Cyt C的表達。提示SiNP可以誘導HUVEC內ERS反應。而促凋亡活性物質Cyt C表達升高，也表明SiNP誘導HUVEC凋亡。

SiNP被細胞內吞后，常定位于內質網[7]。其中，定位于內質網的SiNP可能影響內質網微環境，而干擾其對合成蛋白質的折疊，進而觸發UPR[8-9]。當內質網內存在大量未折疊蛋白后，細胞常升高內質網內伴侶蛋白Bip、Calnexin和PDI等ERS的內在標志物的表達，以便促進內質網內蛋白的折疊[10]。SiNP升高內質網內Bip、PDI、Calnexin表達后，內質網內的未折疊蛋白理論上應該減少，ERS反應應該逐漸減弱，但由于SiNP是細胞不能降解的顆粒物，其在內質網中長期存在，就會干擾內質網微環境，影響蛋白質折疊，從而誘導UPR反應。持續的UPR反應則促進ERS的經典通路被激活，進而高表達促凋亡活性物質Cyt C，促進細胞凋亡[10-11]。研究表明，持續的ERS導致的細胞死亡需由CHOP介導[12]。其中，環境污染物通過CHOP介導的細胞凋亡與蛋白質的合成增加有關[13]。SiNP通過誘導ERS途徑致HUVEC凋亡提供了理論基礎，而本課題組前期結果[1]及本研究結果從試驗的角度證實了這一假設。

綜上所述，SiNP能致HUVEC氧化遺傳損傷、ERS和凋亡，對心血管系統的健康具有潛在的風險。