單細胞測序技術在腫瘤中的研究進展

鄧南星， 白 雪， 張志偉

(南華大學衡陽醫學院 1.人體形態實驗中心，2.腫瘤研究所，湖南省衡陽市 421001)

腫瘤異質性普遍存在細胞間，其通過與腫瘤微環境相互作用，促使腫瘤分化形成不同細胞亞型并發生轉移擴散。因此，了解腫瘤細胞的異質性對于腫瘤的診斷、明確腫瘤性質以及針對性治療均有重要影響。傳統測序技術通過對腫瘤細胞進行批量測序得到群體細胞的相關信息,反映的是細胞群的總體特征，不能特異性地了解腫瘤細胞的異質性。單細胞測序技術通過單個細胞檢測腫瘤細胞的異質性、鑒定稀有細胞、劃分細胞亞群、追蹤細胞譜系、定位突變基因、發現新的腫瘤生物標記物等。本文將從測序技術的進展、單細胞測序技術的方法及其在腫瘤中的應用等3方面進行綜述，并對其發展前景進行展望。

1 測序技術的進展

自20世紀70年代第一代測序技術(雙脫氧鏈終止法)問世以來，目前測序技術已經發展到第四代(原位測序法)。原位測序法可用來驗證已知的腫瘤分子生物標記物從而實現組織異質性的可視化，但原位測序法通常是通過對細胞群進行測序從而得到該細胞群的相關平均差異信息。

從分子角度來看，細胞是人體生命活動的基本單位，是組織構成成分。了解單個細胞的異質性，可以更好地了解疾病發生發展規律。單細胞測序技術是在單個細胞水平，對全基因組、轉錄組和表觀遺傳學的測序，其廣泛應用于癌癥、胚胎發育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究，其在細胞亞型分類、鑒定稀有細胞、繪制細胞譜系等方面具有重要作用。

2 單細胞測序技術的步驟

2.1 單細胞分離

單細胞測序的第一步是將單個目標細胞或細胞核從組織中分離出來。即通過機械破壞或化學酶解組織制成含有目標細胞的細胞懸液，并保持細胞活力，然后在細胞懸液中將單個目的細胞分離出來，送到下游的分析中。單細胞分離要求最大程度上維持細胞的自然表達譜。目前廣泛應用的單細胞分離方法有持(連)續稀釋法、顯微操作篩選法、激光捕獲顯微切割法、熒光激活流式細胞篩選法、微流控技術分離法[1]、Cell Search分離法[2]、MagSweeper分離法、CellCelector分離法以及Nanofilters分離法等九種(表1)[3]。

表1 不同單細胞分離方法的主要優缺點及適用細胞的比較

2.2 單細胞核酸的擴增

一般單細胞中RNA和DNA的含量極低(不足10 pg)，均不足以進行單細胞測序。因此進行單細胞測序前需要對目標單細胞中的超微量遺傳物質核酸進行前期擴增,從而大幅提高核酸含量以便滿足后續實驗分析。依據核酸擴增內容不同主要分為單細胞全基因組擴增(whole-genome amplification,WGA)與單細胞全轉錄組擴增(whole-transcriptome amplification,WTA),相較于WGA步驟,WTA主要多了逆轉錄過程[3]。

目前常見的WGA依據原理不同可分為以PCR反應為基礎的熱循環擴增法以及不以PCR為基礎的等溫反應擴增法。前者主要有相關引物延伸預擴增PCR法、標簽隨機引物PCR、簡并寡核苷酸引物PCR[4]等，后者主要有基于多次退火環狀循環的擴增技術、多重替換擴增技術等。WTA法是先將RNA逆轉錄成cDNA后，后續步驟同WGA法[3]。

2.3 單細胞測序

單細胞測序近年來發展迅速,伴隨著單細胞分離技術、核酸擴增方法及高通量測序技術的不斷進步與完善，三者融合交叉逐步發展出多種單細胞測序方法。如單細胞轉錄組測序[3]、基于TN5轉座酶染色質水平單細胞測序法[5]、單細胞全基因組文庫組合索引測序[6]、單細胞染色質免疫共沉淀測序[7]等。單細胞轉錄組測序法細胞的RNA依次通過逆轉錄、核酸擴增和高通量測序后對獲得的相關數據進行后續生物信息學分析[3]。

目前單細胞測序技術繼續向著高質量、高通量和低成本以及多性能的方向發展，逐漸在腫瘤診斷和臨床治療等研究領域發揮著越來越重要的作用。

3 單細胞測序技術在腫瘤中的應用

腫瘤在致瘤因素作用下由正常細胞惡化增殖演化成為癌細胞，并在演變過程中不斷積累突變、逐漸分化出不同的遺傳譜系和亞群，從而形成了腫瘤內的異質性[8]。腫瘤存在的瘤內異質性與腫瘤的侵襲、轉移能力密切相關，也影響著患者的臨床診斷和治療，但傳統的測序方法對于研究腫瘤內的異質性存在諸多困難。

單細胞測序技術廣泛應用于腫瘤研究中：如依托單細胞測序數據可以量化變異拷貝數從而揭示基因組多樣性；揭示腫瘤細胞的分子表型，構建腫瘤進化圖譜，繪制腫瘤系統發育樹等[9]，從而推斷出不同類型腫瘤細胞的進化過程；可識別潛在的驅動基因，發現罕見的亞克隆群體，為制定分子靶向治療方案，預防化療耐藥和腫瘤復發具有重要意義[10]。單細胞測序技術推動基因組學研究，為研究腫瘤進化結構提供高分辨率視圖，使得在單細胞水平研究腫瘤發展的分子機制成為可能。

3.1 消化系統腫瘤

Wu等[11]對來自食管鱗狀細胞癌和食管腺癌患者的368個單細胞進行分析，發現這兩種類型的食管癌各自具有顯著的瘤內異質性和獨特的內在特性。這種內在特性主要體現在各自的微環境和不同的生物標記物方面。并且兩種食管癌中其相關腫瘤信號通路WNT和NOTCH也有明顯不同。

Dai等[12]通過對1名結直腸癌患者的相關癌組織進行單細胞RNA逆轉錄組測序研究后發現該患者癌組織標本中的2 824個細胞可細分為5種不同的細胞類別，這5種細胞類型的數量差異并具有不同的功能。Wu等[13]通過對2例腺瘤性息肉的大腸癌患者進行單細胞全外顯子組測序，闡述了大腸癌的分期變化過程和腫瘤內異質性。Roerink等[14]第一次在遺傳、表觀遺傳、轉錄和功能水平上對來自結腸癌的多個單細胞來源的克隆進行了系統的分析，全面描述了單個癌細胞中的體細胞突變。研究發現，癌細胞亞型是根據不同增殖與遷移能力的細胞亞群來區分，具有獨特增殖特征的導管細胞亞群與腫瘤浸潤性T細胞的失活狀態密切相關[15]。Zhang等[16]通過對56 440個胃癌及正常胃黏膜單細胞進行轉錄分析，構建了胃黏膜單細胞圖譜，確定了可以通過HES6標記的杯狀細胞識別早期腸化生。Andor等[17]通過對來自9個胃癌細胞系中數千個細胞的基因組和轉錄組的拷貝數變異進行分析，揭示了胃癌的體外進化規律，并在每個細胞系中均發現存在2～12個亞克隆，從而證實了胃癌細胞系中具有顯著的腫瘤內異質性。

Hou等[18]通過對肝細胞癌組織樣本的25個腫瘤單細胞進行單細胞三重組體測序，證實了單個肝癌細胞在基因組、DNA甲基組和轉錄組水平的異質性。Duan等[19]構建了不同形態學表型的HBV相關肝癌模型，通過對3例HBV相關肝癌患者的96個腫瘤細胞進行單細胞基因組測序，揭示了腫瘤異質性與組織形態學之間的聯系。大部分的腫瘤是單克隆起源，而在這項研究中他們證明了一種多克隆腫瘤，即融合多結節形態的腫瘤。

3.2 肺癌

根據組織病理學分類，肺癌可分為非小細胞肺癌(鱗癌、腺癌和大細胞癌)和小細胞肺癌。小細胞肺癌發生轉移較早，其惡性程度最高。因接受治療的小細胞肺癌患者可以收集的腫瘤組織細胞較少，從而阻礙了對其基因組的相關研究。SU等[20]通過對48例小細胞肺癌患者的單個循環腫瘤細胞進行單細胞全基因組測序，推測出小細胞肺癌的發生發展過程并繪制了基因突變圖譜，并證實大多數突變都可以在CTC細胞中檢測到，同時發現存在明顯的DNA異質性，而這種異質性可能是由于等位基因缺失造成的。Sharma等[21]通過對5例非小細胞肺癌患者利用單細胞RNA測序結合多區批量測序技術發現了一些新的亞克隆簇，這些亞克隆簇增殖速率差異存在顯著性，肺癌的異質性在腫瘤間和腫瘤內是不同的。

3.3 乳腺癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，通常依據蛋白質標志物(雌激素受體ER、孕激素受體PR和人表皮生長因子受體HER2)的不同，將乳腺癌分為luminal A、luminal B、HGR2-enriched和三陰性乳腺癌等類型[22]。一直以來，乳腺癌的腫瘤異質性是影響臨床診斷和治療效果的關鍵因素，因此全面了解乳腺癌的表型和分子多樣性對改善分子靶向治療、準確判斷預后和提高患者生存質量至關重要。Savas等[23]通過對乳腺癌患者分離的6 311個T細胞進行了單細胞轉錄組測序分析，結果發現在乳腺癌腫瘤組織中存在大量浸潤性淋巴細胞且這些淋巴細胞存在明顯的異質性。Karaayvaz等[24]通過對6例原發性三陰性乳腺癌(TNBC)患者的1 500多個腫瘤細胞進行單細胞轉錄組測序分析后發現TNBC的功能異質性與癌基因組進化存在密切關系。Wagner等[25]通過對乳腺癌癌組織處的外周血液、癌組織附近的淋巴結組織及相關正常組織進行相關單細胞測序研究，結果發現ER+/-乳腺癌患者相關組織中與PD-L1腫瘤相關的巨噬細胞和衰竭的T細胞大量表達。

3.4 宮頸癌

Yang等[26]通過對宮頸癌患者放療前后腫瘤組織的25個宮頸細胞進行單細胞全基因組測序并對測序數據進行分析后發現放療前后腫瘤細胞的表型差異有顯著性。放療前的腫瘤細胞中至少包含2個亞群，即主要細胞亞群Ⅰ和次要細胞亞群Ⅱ。而經過放療后，主要細胞亞群Ⅰ中的大部分細胞發生死亡，次要細胞亞群Ⅱ損傷較少而轉換為主要細胞亞群，同時NFKB1基因可以增強放射治療的敏感性[27]。

4 總結與展望

單細胞測序技術目前已經廣泛應用于發育生物學、免疫學、腫瘤的各個研究領域，極大促進了單細胞基因組學、表觀基因組學、蛋白質組學的發展。隨著單細胞測序技術的進步與發展，人們檢測到的細胞參數、細胞類型和分子越來越多，特別在腫瘤研究領域，單細胞測序技術能有效地劃分細胞群體、鑒別稀有細胞，準確描述腫瘤的進化過程，同時為癌癥患者早期篩查和制定個性化臨床治療方案提供了理論依據。

單細胞測序技術及應用存在一些不足，如目前單細胞測序技術在核苷酸擴增步驟容易產生擴增偏差，出現非特異性擴增；僅適用于懸浮細胞液不能有效分析細胞或組織的相關空間信息等。近年來單細胞測序技術一直在向著高效低成本、高通量和高質量方向發展，隨著相關技術不斷改進，可以預見未來單細胞測序技術會變得更加精細、更加廣泛適用于科研實驗和臨床診斷工作中。