miR-26a下調TET抑制人宮頸癌HeLa細胞增殖與侵襲

雷林宸， 譚志琴， 楊春秀， 劉玲燕， 吳鵬

(1.衡陽市婦幼保健院重癥醫學科，湖南省衡陽市 421001；2.南部戰區空軍醫院婦產科，廣東省廣州市 510060)

宮頸癌為全世界最常見的女性惡性腫瘤之一，嚴重危害婦女的身心健康。盡管手術、化療、放療、內分泌治療及靶向治療等已取得進步，但是對于復發轉移性宮頸癌的療效欠佳[1]。因此，尋找宮頸癌特異性治療靶點是宮頸癌研究亟待解決的問題，是延長宮頸癌患者生存時間和改善其生活質量的關鍵。

TET蛋白是生物體內存在的一種雙加氧酶，也是DNA去甲基化過程中的一種重要酶。TET蛋白家族包括3個成員TET1、TET2和TET3，TET對基因的轉錄調控具有激活與抑制雙重功能，TET家族成員發生的結構異常或基因突變常與人類造血系統惡性腫瘤的發生關系緊密[2]。過表達TET可促進宮頸癌HeLa細胞轉移[3]。但目前TET蛋白在宮頸癌中的作用機制尚不明確。microRNA(miRNA)為一類內源性的非編碼小分子RNA，其通過與mRNA 3′-UTR區域的配對，可實現對基因轉錄水平的負性調控。miR-26a已被發現與宮頸癌的進展過程密切相關[4],在胃癌發生過程中miR-26a能直接靶向調控TET的表達[5]。本研究探討TET蛋白家族3個成員TET1、TET2和TET3對宮頸癌細胞增殖與侵襲的影響，并探究其調控宮頸癌細胞增殖與侵襲的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人宮頸癌HeLa細胞(中國科學院上海生命科學院生化細胞所)，轉染試劑Lipofectamine 3000、RNA提取試劑TRIzol、細胞培養基DMEM、細胞培養胎牛血清以及抗生素、miR-26a模擬物及對照(scramble)引物和其內參U6、TET1、TET2、TET3的干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)序列及其對照(control)無關序列(Invitrogen，美國)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems，美國)，TaqMan反轉錄試劑盒、qSYBR-Green-containing PCR試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Qiagen,美國)，血細胞計數板(16×25格)，Transwell小室和基質膠(BD，美國)，紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop 2000，美國)，奧林巴斯正置顯微鏡OLYMPUS BX51(Olympus公司，UIS2光學成像系統，日本)。突變型TET1、TET2、TET3的3′-非翻譯區(3′-UTR)的熒光素酶報告載體(TET1-mut、TET2-mut和TET3-mut)、野生型TET1、TET2、TET3的3′-UTR的熒光素酶報告載體(TET1-wt、TET2-wt和TET3-wt)由GeneCopoeia公司構建。

1.2 細胞培養及分組

人宮頸癌HeLa細胞培養于含10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素(雙抗)的DMEM培養基中，細胞置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱內孵育。

細胞實驗分為si-TET1組、si-TET2組、si-TET3組、si-control組。si-TET1、si-TET2、si-TET3分別轉染TET1、TET2、TET3的干擾小RNA序列，si-control組轉染其對照無關序列。si-TET1、si-TET2、si-TET3序列分別為5′-GCACGCATGAATTTGGATA-3′、5′-CTGCTTCTGTTCTCAATAA-3′、5′-CCACCTGCGATTGCGTCGAACAAAT-3′，si-control組序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。

1.3 細胞轉染

采用0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的宮頸癌HeLa細胞，并將其吹打成單個細胞，每個六孔板中鋪2 mL細胞(共8×103個)置于細胞培養箱中。按照Lipofectamin 3000說明書進行操作，分別轉染si-control、si-TET1、si-TET2、si-TET3以及scramble、miR-26a，轉染8 h后，更換為常規細胞培養基，48 h后可收集細胞用于后續實驗。

1.4 RNA提取及qRT-PCR實驗

每六孔板內加100 μL TRIzol裂解液，室溫靜置5 min，加入140 mL氯仿并震蕩20 s后室溫放置8 min，以轉速15 000 r/min，4 ℃離心20 min，轉移上層液體至另一干凈EP管內，按1體積的異丙醇、2體積的TRIzol加入上層液體中，將其混勻后室溫靜置18 min，隨后離心移除上清液體。加入500 μL 75%乙醇沖洗離心管底部的沉淀物，以轉速12 000 r/min，4 ℃離心15 min，隨后移除上清液并將底部沉淀物溶于30 μL無酶水。于紫外可見分光光度計上檢測A260/A280比值，檢測合格后于-80 ℃冰箱內保存備用。

按照產品說明書進行qRT-PCR實驗，提取細胞中RNA后進行反轉錄，并進行后續的操作。miR-26a的引物序列為F:5′-ATGGCTTCAAGTAATCC-AGGA-3′；R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，內參U6的引物序列為F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGC-GT-3′。miRNA的相對表達量采用公式2-ΔΔCT計算。

1.5 細胞增殖曲線檢測細胞增殖能力

將宮頸癌HeLa細胞經0.25%胰酶消化后，將細胞調至5×103個/mL，隨后將其接種到24孔板中，每孔500 μL，采用血細胞計數板(16×25格)統計細胞數量(每毫升細胞數=400×每小格細胞數×104×稀釋倍數)，每24 h計數一次，連續4天，繪制細胞增殖曲線圖。

1.6 克隆形成實驗

采用0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的宮頸癌HeLa細胞，吹打成單個細胞，以梯度倍數稀釋，每組設置3個平行樣。每組細胞均在六孔板中接種，每孔100個細胞，輕輕晃動細胞使其均勻分散。置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育。結晶紫染色，顯微鏡鏡下計數克隆形成的具體數目。

1.7 細胞侵襲實驗

在Transwell小室內鋪加基質膠，靜置6 h待其成膜。取上述細胞稀釋液150 μL接種到小室上腔層，下腔層內添加350 μL完全培養基，靜置，于培養箱內孵育36 h后結晶紫染色。將上室中內側細胞用棉簽除去，PBS緩沖液清洗3次，倒置小室并晾干，于倒置顯微鏡下進行細胞計數。

1.8 熒光素酶活性檢測

熒光素酶報告基因實驗分為TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt、TET1-mut、TET2-mut、TET3-mut的miR-26a組、scramble組。分別共轉染到宮頸癌HeLa細胞株中，48 h后收集細胞，根據試劑盒說明書操作，驗證TET與miR-26a的結合關系。

1.9 統計學方法

2 結 果

2.1 敲低TET對宮頸癌HeLa細胞增殖能力的影響

細胞增殖曲線結果顯示，與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組和si-TET3組的宮頸癌HeLa細胞增殖能力均顯著降低(P<0.05；圖1)。

圖1 敲低TET對宮頸癌HeLa細胞增殖能力的影響a為P<0.05，與si-control組比較。

2.2 敲低TET對宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的影響

與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組和si-TET3組細胞克隆形成數量均顯著降低(P<0.05；圖2)。即外源性敲低TET的表達，可顯著降低宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力。

圖2 敲低TET對宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力的影響A為宮頸癌HeLa細胞的克隆染色圖片；B為克隆數量柱狀圖。a為P<0.05，與si-control組比較。

2.3 TET對宮頸癌HeLa細胞侵襲能力的影響

與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組、si-TET3組穿過基質膠的宮頸癌HeLa細胞數量均顯著降低(P<0.05；圖3)。即外源性敲低TET的表達，可顯著降低宮頸癌HeLa細胞的侵襲能力。

圖3 敲低TET對宮頸癌HeLa細胞侵襲能力的影響A為穿過基質膠的宮頸癌HeLa細胞染色圖片(0.5%結晶紫染色，200×)；B為穿過基質膠的宮頸癌HeLa細胞數量柱狀圖。a為P<0.05，與si-control組比較。

2.4 miR-26a通過TET抑制宮頸癌HeLa細胞增殖與侵襲

TargetScan在線軟件預測結果顯示TET1、TET2和TET3均可與miR-26a直接結合(圖4A)。與共轉染TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt的scramble組比較，共轉染TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt的miR-26a組的細胞熒光素酶活性均顯著降低(P<0.05，圖4B)。與轉染scramble比較，轉染miR-26a后，宮頸癌HeLa細胞中TET1、TET2、TET3 mRNA均顯著降低(圖4C)。

圖4 TET與miR-26a之間的結合關系的證實A為TargetScan軟件預測TET1、TET2、TET3 mRNA 3′-UTR區域可與miR-26a結合；B為各組熒光素酶活性；C為qRT-PCR檢測轉染scramble和miR-26a后，宮頸癌HeLa細胞中TET1、TET2、TET3 mRNA相對表達量。a為P<0.05，與scramble組比較。

3 討 論

宮頸癌由感染某些高風險、致癌類型的人乳頭瘤病毒引起。宮頸癌篩查和接種HPV疫苗均可降低其死亡率、防止宮頸癌前體病變的發生，但其低診斷率和復發轉移治療仍是亟待解決的重要問題[6-7]。

TET1、TET2、TET3共同構成TET蛋白家族，三者均具備將5mC轉化成5hmC的能力[8]。研究表明TET家族成員可同時激活或抑制基因的轉錄調控，TET家族成員可通過參與DNA的去甲基化過程而激活對基因的轉錄調控，但TET1被認為可轉錄抑制部分基因，該作用可能與羥化酶活性無關[9]。同時TET家族成員介導的DNA去甲基化過程也與多種腫瘤的發生密切相關。研究證實，TET蛋白家族的基因突變或結構異常，常與哺乳動物的造血系統惡性腫瘤密切關聯[2]，在急性粒細胞白血病患者中TET1可與組蛋白甲基轉移酶基因融合[10]。但目前TET蛋白在宮頸癌中的作用機制尚不明確。研究發現，過表達TET可促進宮頸癌細胞轉移[3]。本研究中通過干擾TET1、TET2、TET3表達均可顯著抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖、克隆形成和侵襲，提示TET可能在宮頸癌發生、發展中起著重要的作用。

miR-26a屬miR-26家族，miR-26a基因存在兩個染色體位點，miR-26a-1位于3號染色體CTDSPL基因內含子，miR-26a-2位于12號染色體CTDSP2內含子，miR-26a與其宿主基因CTDSPL/2共同轉錄，其轉錄受共同啟動子序列調控[11]。研究顯示miR-26a具有顯著的抑瘤功能[12-15]。本課題組前期研究證實miR-26a可通過靶向MCL1抑制宮頸細胞增殖與侵襲，誘導宮頸癌細胞凋亡[16]；miR-26a在宮頸癌組織和細胞中表達下調，其下調與宮頸癌的臨床分期、淋巴結轉移、預后等顯著相關；此外，miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌的侵襲與轉移[17]。

一個miRNAs可調控多個靶基因，同一個靶基因也可以受多個miRNAs調控。mRNA之間可通過miRNAs反應元件達到相互調控的目的，該調控機制即競爭性內源RNA(ceRNA)機制具有相同miRNAs反應元件的mRNAs、假基因、lncRNA等轉錄物通過競爭性結合同種miRNAs調控其表達水平，從而影響細胞的功能[18]。Kou等[19]發現，HMGA2能調控let-7靶基因TGFBR3的表達，作為ceRNA促進肺癌細胞侵襲及轉移。

研究顯示，在胃癌的發生發展過程中，miR-26a能直接靶向調控TET1、TET2、TET3的表達[5]，因此推測TET可能是作為miR-26a的ceRNA而發揮促進宮頸癌生長與轉移作用。本研究中，經靶點預測和qRT-PCR實驗證實TET1、TET2、TET3均為miR-26a調控的靶基因，在宮頸癌HeLa細胞中通過熒光素酶報告基因實驗證實miR-26a能與TET1、TET2、TET3 mRNA 3′非編碼區結合抑制熒光素酶活性。上述結果證實TET1、TET2、TET3均為miR-26a靶基因。因TET蛋白對其下游靶基因具有轉錄激活或抑制作用[2]。通過siRNA敲低TET1、TET2、TET3的表達均可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、克隆形成及侵襲能力，抑制TET尤其是TET2這種不依賴于編碼蛋白發揮抑制宮頸癌HeLa細胞轉化的功能，提示TET可能作為ceRNA而發揮功能。研究顯示，miR-26a調控的靶基因有MTDH[20]、SMAD1[21]和GSK-3β[22]等，TET1、TET2、TET3很可能作為ceRNA調控這些基因的表達，或通過調控宮頸癌組蛋白甲基化修飾或者通過調控miR-26a其他靶基因參與不同的信號通路，從而實現調控宮頸癌的發生發展。