白喉烏頭對RA大鼠B10細(xì)胞和炎癥因子的影響

孟巖， 叢珊， 羅莉

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市 830054)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其特征是持續(xù)性炎癥性滑膜炎、關(guān)節(jié)破壞和功能喪失[1]。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞是指對免疫應(yīng)答具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的一類細(xì)胞，表面高表達(dá)CD5、CD19等分化抗原，該亞群主要通過分泌白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)抑制免疫反應(yīng)，故研究者將其命名為B10細(xì)胞[2]。有研究指出，新發(fā)RA患者B10細(xì)胞數(shù)量和功能均有缺損，B10細(xì)胞及其相關(guān)因子在RA的病理進(jìn)程中呈現(xiàn)出有規(guī)律的動(dòng)態(tài)變化是治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。目前，臨床治療RA以抗風(fēng)濕藥物、非甾體類抗炎藥及糖皮質(zhì)激素為主，但因用藥周期長且不良反應(yīng)大，急需探尋一種療效明顯且藥物不良反應(yīng)小的新藥物。白喉烏頭為毛茛科烏頭屬草本植物，廣泛分布于新疆北部地區(qū)，其根部具有止痛消炎、通經(jīng)活絡(luò)的功效，可用于治療風(fēng)寒濕痹[4]。本研究建立RA大鼠模型，評價(jià)白喉烏頭對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠B10細(xì)胞及其炎癥因子的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

白喉烏頭由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；牛Ⅱ型膠原(美國Chonderx公司)；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；雷公藤多苷片(浙江恩德制藥股份有限公司，批號1808132B)；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(杭州聯(lián)科生物)；大鼠IL-10、IL-12 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物)；蘇木精染色液、脫蠟液、PBS緩沖液、1%酸性乙醇分化液、中性樹膠(北京索萊寶公司)；免疫組織化學(xué)試劑盒、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(北京中杉金橋生物科技有限公司)；CD19、CD5抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。酶標(biāo)儀(北京凱奧科技發(fā)展有限公司，型號K6600A)。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立

40只SPF級雌性Wistar大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量(250±20) g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK(新)2018-0002。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、低劑量組、高劑量組與陽性對照組，每組8只。空白對照組不做任何處理，正常飼養(yǎng)，其余4組均通過局部注射Ⅱ型膠原乳劑法建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型[5]，于注射后3周末評估關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)，AI總分≥6分即為造模成功[6]。造模成功后，模型組生理鹽水灌胃，低劑量和高劑量組每天22.5、45 mg/kg白喉烏頭灌胃，陽性對照組每天1 mg/kg雷公藤灌胃，每次灌胃1 mL，每天1次，連續(xù)4周。

1.3 HE染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化

摘取大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)，剝?nèi)∑浠そM織，常規(guī)石蠟包埋，制備病理切片。所得切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，滴加蘇木精染色液充分染色10 min，雙蒸水沖洗干凈后1%鹽酸乙醇分化10 s，伊紅染色3 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理組織變化。

1.4 免疫組化法檢測滑膜組織B10細(xì)胞表面抗原CD19、CD5表達(dá)

病理切片常規(guī)脫蠟脫水，滴加3% H2O2去除內(nèi)源性酶，PBS清洗后置入微波爐抗原修復(fù)15 min。滴加封閉液，37 ℃封閉30 min。一抗4 ℃過夜孵育，PBS清洗后二抗37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗至顏色變清。常規(guī)脫水，封片。每組選3張切片，每張切片選取3個(gè)不同的視野在正置光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核顯示棕黃色顆粒被定義為染色陽性細(xì)胞。采用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics)軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算各組切片累積光密度值(OD)，所計(jì)算出的累積光密度值表示候選蛋白的表達(dá)水平。

1.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-12的水平

大鼠最后一次給藥24 h后，取各組大鼠外周血，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，-20 ℃下保存。采用ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-12水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.00軟件包進(jìn)行分析及制圖。組間比較進(jìn)行重復(fù)測量方差分析；兩組獨(dú)立樣本比較采用Student’st-test(偏態(tài)分布采用t’-test)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型制備結(jié)果

模型組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組分別有7只、8只、6只、6只造模成功，整體模型制備成功率為84.4%(27/32)，各組之間的AI評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組大鼠模型制備結(jié)果

2.2 各組大鼠滑膜組織病理變化

空白對照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜平整光滑；模型組有水腫及纖維組織增生；低劑量組、陽性對照組有少量纖維組織增生；高劑量組滑膜病變不明顯，有輕微水腫，無纖維組織增生(圖1)。提示高劑量白喉烏頭治療效果優(yōu)于低劑量。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理結(jié)果(HE染色，100×)

2.3 各組大鼠滑膜組織CD5和CD19蛋白表達(dá)的比較

與空白對照組比較，模型組B10細(xì)胞表面抗原CD5、CD19蛋白表達(dá)均增高(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組和陽性對照組CD5、CD19蛋白表達(dá)均降低(P<0.05；圖2)。

圖2 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織免疫組化結(jié)果A為典型的免疫組織化學(xué)圖(蘇木精染色，200×)；B為B10細(xì)胞表面抗原CD5、CD19蛋白表達(dá)水平柱狀圖。a為P<0.05，與空白對照組比較；b為P<0.05，與模型組比較。

2.4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β水平增加(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽性對照組TNF-α、IL-6、IL-12、IL-1β水平均降低(P<0.05)；高劑量組TNF-α水平低于低劑量組(P<0.05；表2)。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 單位：ng/L

3 討 論

B細(xì)胞傳統(tǒng)上被認(rèn)為是體液免疫反應(yīng)的積極調(diào)節(jié)者。近年研究表明[7]，富產(chǎn)IL-10的鼠脾臟B10細(xì)胞在改善自身免疫性疾病方面具有積極作用。研究者在未接受治療的RA患者的外周血中檢測到大量IL-10活性B細(xì)胞，推測可能是機(jī)體面對疾病時(shí)自發(fā)的一種代償機(jī)制[8]；后期研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期RA患者血清中B10細(xì)胞頻率有明顯降低，并伴有免疫抑制活性的減弱，這說明B10細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下受損，可能導(dǎo)致了RA病情加重[9]。本研究擬建立RA大鼠模型，觀察病情進(jìn)展過程中B10細(xì)胞表面抗原CD5、CD19表達(dá)的變化。

本研究結(jié)果顯示，RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中B10細(xì)胞表面抗原CD5、CD19表達(dá)高于空白對照組，這與既往其他學(xué)者的報(bào)道結(jié)果基本一致[10-11]。本文結(jié)果提示白喉烏頭可降低RA大鼠CD5、CD19的表達(dá)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種病因不明的關(guān)節(jié)持續(xù)性衰弱的疾病，TNF-α和IL-1β在疾病進(jìn)程中起核心作用，這兩者的過度分泌有可能刺激滑膜細(xì)胞增殖和組織酶產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨破壞。核因子κB是炎癥信號的關(guān)鍵樞紐，可上調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)，從而促進(jìn)炎性反應(yīng)[12]。燕麗君等[13]研究也觀察到人類和動(dòng)物類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型滑膜關(guān)節(jié)中NF-κB水平的增加，IL-1β和TNF-α是刺激炎癥和骨侵蝕過程的首要介質(zhì)。本研究中，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平增加，與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽性對照組TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，也證實(shí)了RA存在炎性因子過度分泌的情況，而白喉烏頭可以顯著降低其炎性介質(zhì)，緩解炎性損傷。

B10細(xì)胞分泌的IL-10是機(jī)體重要的抗炎因子，可作用于抗原提呈細(xì)胞減少黏附相關(guān)分子的表達(dá)，抑制TNF-α等炎癥因子的釋放，也能夠拮抗Th1。既往有研究指出，RA患者中CD4+T細(xì)胞的分化異常，Th1/Th2細(xì)胞比例失調(diào)并向Th1漂移。考慮到IL-10可抑制Th1活性，而IL-12可加強(qiáng)Th1細(xì)胞活性。本研究結(jié)果顯示，各組之間IL-10水平差異不明性，但與空白對照組比較，模型組IL-12水平增加；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、陽性對照組IL-12水平均降低，這說明Th1細(xì)胞功能呈現(xiàn)出激進(jìn)狀態(tài)，白喉烏頭可在一定程度上發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制Th1細(xì)胞的活性。

白喉烏頭可降低RA大鼠滑膜組織促炎因子的水平，從一定程度上減少滑膜組織炎癥，阻止關(guān)節(jié)進(jìn)一步破壞。本實(shí)驗(yàn)初步為白喉烏頭治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，然而，B10細(xì)胞代表極其罕見的免疫細(xì)胞群，但RA的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，該結(jié)論還需要更系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。