r-hGH聯合DHEA對卵巢低反應小鼠GDF-9、AGE、RAGE表達的影響

劉明穎， 金鑫， 王惠華， 孫強

(大連市婦女兒童醫療中心產科，遼寧省大連市 116033)

卵巢低反應(poor ovary response，POR)是指在藥物刺激的超排卵過程中，卵巢對促性腺激素的刺激反應不佳，臨床研究顯示重組人生長激素(recombinant human growth hormone，r-hGH)可以提高POR患者卵巢反應性[1]。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是機體內類固醇激素合成必需的底物，在r-hGH基礎上聯合使用DHEA可輔助治療POR，但是關于其機制不清楚[2]。晚期糖基化終末產物(advanced glycation end product，AGE)及晚期糖基化終產物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)參與POR的發生[3-4]。生長分化因子-9(growth differentiation factor-9，GDF-9)主要存在于卵泡中，在促進卵泡及顆粒細胞生長分化中起著重要作用[5]。本文分析r-hGH聯合DHEA對卵巢低反應小鼠模型干預及GDF-9、AGE、RAGE的影響，并分析其機制。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

SPF級ICR小鼠購自大連醫科大學實驗動物中心，雌性100只。r-hGH購自安科生物工程。DHEA購自美國GNC公司。重組人絨毛膜促性腺激素(HCG)購自美國Sigma公司。AGE、RAGE和GDF-9抗體購自美國Abcam公司。ELISA試劑盒和HE染色試劑盒購自武漢華美公司。RNAspin Mini購自美國GE Healthcare公司。iScriptTM cDNA合成試劑盒購自美國Bio-Rad公司。Bestar qRT-PCR和BestarTMqPCR試劑盒購自德國DBI Bioscience公司。Fast Start Universal SYBR Green Master試劑盒購自瑞士Roche公司。引物和反向引物由Genewiz公司設計和合成，GAPDH作為內參。

1.2 分組、建模及干預方法

100只雌性小鼠隨機均分為對照組、模型組、r-hGH組、DHEA組和r-hGH+DHEA組。使用慢性制動應激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應模型[6]。對照組和模型組小鼠使用等量的溶劑干預，在制動的第15天r-hGH組小鼠腹腔注射r-hGH，每天0.5 U/次，連續5天；DHEA組使用DHEA灌胃，每次1.25 mg/kg，每日1次，連續5天，若未發現陰栓重復上述步驟；r-hGH+DHEA組小鼠同時接受r-hGH腹腔注射和DHEA灌胃，方法同上。

1.3 血清AMH水平檢測

將小鼠麻醉后脫頸處死，取外周血，使用酶聯免疫吸附法檢測血清抗苗勒管激素(anti-miillerrian hormone，AMH)水平，按照說明書方法操作。

1.4 小鼠卵泡的檢測

HE染色用于檢測小鼠卵巢中卵泡情況。將卵巢組織在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm的切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來水洗滌1～2 min后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min后，將玻片放入蘇木精-伊紅中10 s。在乙醇中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min；重復此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。光學顯微鏡下觀察，并計數卵泡數量。

1.5 卵巢組織中AGE、RAGE和卵泡中GDF-9 mRNA的檢測

使用qRT-PCR法檢測卵巢組織中AGE、RAGE mRNA和卵泡中GDF-9 mRNA的表達水平。使用RNeasy Mini試劑盒取卵巢組織總RNA，然后使用IscriptTMcDNA合成試劑盒將其逆轉轉錄為cDNA，條件如下：37 ℃15 min，98 ℃5 min。然后進行qRT-PCR實驗，條件如下：95 ℃2 min，94 ℃20 s，58 ℃20 s，72 ℃20 s，40個循環，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統進行qRT-PCR分析。通過比較循環閾值并以GAPDH作為內參計算mRNA相對表達水平。

1.6 AGE、RAGE和GDF-9蛋白的水平檢測

Western blotting檢測AGE、RAGE和GDF-9蛋白水平。將細胞使用裂解緩沖液在冰上裂解并收集總蛋白。通過8%的SDS-PAGE分離每個樣品中等量(50 μg)蛋白質，并將其轉移到硝酸纖維素膜上。通過在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h來封閉非特異性抗原。隨后，將膜與分別與一抗(1∶800)4 ℃孵育過夜，然后將膜與山羊抗免IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用化學發光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.7 統計學處理

統計分析使用SPSS 19軟件處理。計量資料采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 各組小鼠AMH水平比較

模型組小鼠血清AMH(2.05±0.15)μg/L，較對照組(6.21±0.51)μg/L降低(P<0.05)，r-hGH組(3.76±0.38)μg/L和DHEA組(3.16±0.24)μg/L高于模型組，r-hGH+DHEA組(5.35±0.42)μg/L高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05)。

2.2 各組小鼠卵泡計數結果比較

建模后小鼠卵泡數目均降低，r-hGH組和DHEA組高于模型組，r-hGH+DHEA組高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表1和圖1)。

表1 各組小鼠卵泡計數結果比較(n=20) 單位：個

圖1 各組小鼠卵泡HE染色結果(400×)A為對照組；B為模型組；C為r-hGH組；D為DHEA組；E為r-hGH+DHEA組。

2.3 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9 mRNA和蛋白水平的比較

小鼠卵巢組織AGE和RAGE mRNA和蛋白水平模型組高于對照組，r-hGH組和DHEA組低于模型組，r-hGH+DHEA組低于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表2和圖2)。

表2 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9 mRNA表達水平的比較(n=20)

小鼠GDF-9 mRNA和蛋白水平模型組低于對照組，r-hGH組和DHEA組高于模型組，r-hGH+DHEA組高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表2和圖2)。

圖2 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9蛋白表達水平比較1為對照組；2為模型組；3為r-hGH組；4為DHEA組；5為r-hGH+DHEA組。a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與模型組比較；c為P<0.05，與r-hGH組比較；d為P<0.05，與DHEA組比較。

3 討 論

POR是輔助生殖技術中面臨的主要難題，且尚無治療POR的特效藥物，通過藥物刺激卵巢提高其反應性、排卵量和體外受精率是治療POR的重點，研究認為高年齡(≥40歲)是POR的危險因素[7]。本文通過慢性制動應激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應模型，建模后小鼠動情周期發生顯著變化，HE染色結果也顯示卵巢功能下降，各個期間的卵泡數目均顯著降低，血清AMH水平也顯著降低，提示建模成功[6]。AMH主要由發育中的竇前卵泡及其周圍的顆粒細胞分泌，是現階段臨床用于評估卵巢儲備和體外受精中卵巢反應性的重要指標。本次研究結果顯示建模后小鼠血清AMH水平和卵泡數目顯著降低。臨床研究已經發現r-hGH的使用可以提高體外受精率[8]。DHEA是最近發現的可以輔助治療POR的藥物，DHEA是合成多種雌性激素的底物，研究發現大于40歲的婦女可通過口服DHEA提高機體中雄烯二酮和總睪酮水平。DHEA可以改善POR患者體外受精-胚胎移植周期[9]。DHEA對POR具有一定的治療效果[10-11]，提示r-hGH聯合DHEA對POR具有更好的效果，但是關于其機制尚不明確。

本研究結果顯示模型組小鼠卵巢組織AGE和RAGE mRNA水平高于對照組，使用r-hGH或DHEA干預后卵巢組織AGE和RAGE mRNA水平降低，并且聯合組的影響更為顯著。建模后小鼠卵泡中GDF-9 mRNA水平降低，使用r-hGH或DHEA干預后GDF-9 mRNA水平升高，聯合使用r-hGH或DHEA上調GDF-9的效果更為顯著。卵巢的衰老是引起POR的主要原因，AGE、RAGE基因可能與卵巢的衰老相關[12]。卵巢卵泡水平的AGE產物積累可能引發早期卵巢衰老[13]，并可能導致顆粒細胞葡萄糖攝取減少，從而可能改變卵泡生長，可能是生殖衰老的潛在機制之一。GDF-9在卵泡發育中有著極為重要的作用，GDF-9不但可以促進卵泡發育，還可以作用于顆粒細胞調節雌激素和孕激素的分泌[14]。DHEA可提高卵泡液中的GDF-9的水平[15]，說明AGE、RAGE的過表達引起的卵巢衰老和GDF-9水平降低影響的卵泡發育不良與POR密切相關，而聯合使用r-hGH和DHEA可能通過調節AGE、RAGE、GDF-9的水平緩解卵巢衰老，促進卵泡發育，從而對POR具有一定的治療效果。

綜上所述，r-hGH聯合DHEA對POR小鼠模型具有較好的干預效果，這可能與其可以下調卵巢中AGE、RAGE mRNA水平并促進GDF-9的表達有關。關于POR的發病機制和r-hGH聯合DHEA對POR的治療機制還需要進一步研究。