蜂毒肽通過線粒體凋亡途徑促進皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株對5-FU的敏感性

宋晗， 田慶均

(1.武漢市紅十字會醫院皮膚科，湖北省武漢市 430015；2.武漢市第一醫院皮膚科，湖北省武漢市 430022)

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是發生于表皮或者附屬器細胞的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢[1]。CSCC治療以手術切除為主，但部分患者在切除后仍出現復發和轉移。單一藥物治療CSCC易產生耐藥性，效果不佳，而同時針對多個腫瘤靶點的聯合用藥治療有助于逆轉耐藥性。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)能穿透細胞膜干擾DNA修復和蛋白質合成，從而抑制細胞增殖，單獨或聯合用于化療效果顯著，但會產生耐藥性[2-3]。蜂毒肽是蜂毒的主要活性物質，具有抗菌、抗炎、抗病毒等效果[4]。研究表明，蜂毒肽可以激活細胞線粒體凋亡途徑，促進細胞凋亡[5]。本文探討蜂毒肽通過線粒體凋亡途徑促進CSCC A431細胞株對5-FU敏感的機制，報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物和細胞

人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株與人正常皮膚HaCaT細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司；40只健康SPF級雄性BALB/c裸鼠購于武漢貝賽模式生物科技有限公司，體質量(20.00±2.00)g，使用許可證號SYXK(鄂)2022-0124，生產許可證號SCXK(鄂)2022-0029。所有小鼠正常飲食飲水，適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養液、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK8試劑盒、Annexin V/FITC細胞凋亡試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；RIPA裂解液購于上海翌圣生物科技有限公司；線粒體凋亡蛋白(Smac)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、細胞色素C(Cyt C)、促凋亡蛋白(Bax)兔抗人一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購于美國Abcam公司。

SpectraMax iD3 多功能酶標儀購于上海美谷分子儀器有限公司；Cytek NL-CLC 全光譜流式細胞儀購于上海聚慕醫療器械有限公司；DYCZ-24DH型雙板垂直電泳儀、WD-9413D型一體式凝膠成像系統購于北京六一儀器廠。

1.3 細胞培養與蜂毒肽濃度的篩選

取對數生長期的A431細胞，胰蛋白酶消化后收集并離心后用無血清DMEM培養液重懸，在96孔板中加入100 μL細胞懸液(2×103個/孔)，培養12 h后分別加入蜂毒肽，細胞培養液終濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2 μmol/L(設置3個復孔)，繼續培養72 h，取出后加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。設置調零孔、空白孔。孵育1 h，采用酶標儀測定各孔在450 nm的光密度值(optical density，OD)。細胞存活率(%)=(待測孔OD值-調零孔OD值)/(空白孔OD值-調零孔OD值)×100%[6]，根據細胞存活率計算半數抑制濃度(IC50)。

1.4 CCK8檢測細胞毒性及細胞存活率

分別收集HaCaT、A431細胞，在96孔板中加入100 μL(2×103個/孔)細胞懸液，并分別分為對照組、蜂毒肽組、5-FU組、聯合組，于CO2培養箱中培養。12 h后對照組不作干預；蜂毒肽組用篩選的IC50濃度的蜂毒肽(0.5 μmol/L)作為終濃度培養；5-FU組用終濃度為0.25 μmol/L 5-FU溶液培養；聯合組用0.5 μmol/L蜂毒肽溶液和0.25 μmol/L 5-FU溶液共同培養，設置3個復孔，繼續培養24、48、72 h。取出加入10 μL 5 g/L CCK-8溶液。孵育1 h，酶標儀測定各孔在450 nm OD值。細胞存活率計算公式同方法1.3。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率與細胞周期

各組A431細胞培養72 h后，收集細胞，加100 μL 1×Binding Buffer重懸。加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution混勻。室溫下避光反應15 min。加400 μL 1×Binding Buffer，混勻，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

取上述離心后細胞用DMEM培養基重懸，以2×104個/mL接種于6孔板中，培養24 h。棄去上清液，PBS洗2次，加70%乙醇固定細胞(4 ℃過夜)，向各孔中加300 μL 50 mg/L PI+10 μL 100 mg/L RNase，4 ℃中避光孵育30 min，流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。

1.6 Western blotting法檢測Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達水平

取1.5中各組細胞，收集后加200 μL RIPA裂解液，充分裂解后12 000 r/min離心，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠電泳，結束后依次進行轉膜、封閉(5%脫脂奶粉)、一抗孵育(1∶1 000稀釋)、二抗孵育(1∶500稀釋)，洗膜，用ECL化學發光劑顯色。在凝膠成像儀中觀察目的蛋白條帶，以β-actin作為內參蛋白，計算各蛋白的相對灰度值。

1.7 體外荷瘤檢測腫瘤生長抑制率

將40只BALB/c裸鼠隨機分為4組(對照組、蜂毒肽組、5-FU組、聯合組)，每組10只。取1.6中各組處于對數生長期的各組A431細胞在同一組名的裸鼠背部進行皮下接種，每只裸鼠的接種量為0.3 mL(1×108個/mL)。在接種后的第3天開始測量腫瘤體積，此后每3天測量一次，接種后的第30天測量腫瘤體積后將各組裸鼠處死，飼養期間對照組有3只裸鼠死亡，蜂毒肽組有1只裸鼠死亡，剔除死亡裸鼠數據后，其他數據均納入統計分析。根據第30天腫瘤體積計算抑瘤率：腫瘤體積(V)=長×寬2/2；抑瘤率(%)=(1-V待測/V對照)×100%。

1.8 統計分析

數據均采用SPSS 25.0版軟件進行分析處理，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 蜂毒肽濃度篩選

隨著蜂毒肽濃度的增加，A431細胞存活率逐漸下降，IC50為0.51 μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度蜂毒肽對A431細胞存活率的影響

2.2 蜂毒肽對各組HaCa T細胞毒性的影響

與對照組和蜂毒肽組比較，72 h時5-FU組和聯合組的HaCaT細胞存活率降低(P<0.05;表1)。

表1 不同時間各組HaCaT細胞存活率的比較 單位：%

2.3 蜂毒肽對各組A431細胞存活率的影響

與對照組比較，不同時間點蜂毒肽組、5-FU組、聯合組的A431細胞存活率均降低(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，不同時間點下聯合組的A431細胞存活率均降低(P<0.05;表2)。

表2 不同時間各組A431細胞存活率的比較 單位：%

2.3 各組細胞凋亡率和細胞周期的比較

與對照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯合組A431細胞凋亡率增加(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組，聯合組細胞凋亡率增加(P<0.05；圖2)。與對照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯合組G0/G1期細胞比例增加(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯合組G0/G1期細胞比例增加(P<0.05)。與對照組比較，蜂毒肽組、5-FU組、聯合組S期與G2/M期細胞比例降低(P<0.05)；與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯合組S期與G2/M期細胞比例降低(P<0.05；圖3)。

圖2 流式細胞儀檢測各組A431細胞培養72 h時的凋亡情況a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞培養72 h時的細胞周期a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

2.4 各組細胞Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達水平的比較

與對照組比較，蜂毒肽組、聯合組的細胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達均增加(P<0.05)；與5-FU組和蜂毒肽組比較，聯合組細胞的Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax蛋白表達均增加(P<0.05；圖4)。

圖4 各組細胞培養72 h時細胞中Smac，cleaved Caspase-3，Cyt C，Bax蛋白表達水平a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與5-FU組比較，c為P<0.05，與蜂毒肽組比較。

2.5 各組腫瘤生長抑制率的比較

腫瘤生長第15～30天，與對照組、蜂毒肽組和5-FU組比較，聯合組的腫瘤體積縮小(P<0.05)。第30天蜂毒肽組、5-FU組、聯合組的腫瘤生長抑制率差異有顯著性(P<0.05；圖5)。

3 討 論

5-FU是一種抗嘧啶代謝藥物，其代謝產物可阻斷尿嘧啶脫氧核苷轉化為胸腺嘧啶脫氧核苷，阻止DNA和RNA的合成[7]。但長期使用5-FU會使腫瘤細胞的敏感性降低，產生耐藥性[8]。線粒體參與了細胞凋亡的過程，當細胞受到DNA損傷等外界刺激時，會激活細胞內線粒體凋亡途徑，促使細胞發生程序性凋亡[9]。

本研究中，蜂毒肽組、5-FU組、聯合組的A431細胞存活率降低，且聯合組降低更明顯，說明蜂毒肽可增強人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞對5-FU的敏感性。蜂毒肽是一種蜂毒中分離出的功能性物質，約占蜂毒干重的50%，研究顯示，蜂毒肽可抑制人口腔鱗狀細胞癌的增殖存活率，抑制細胞遷移[10]。本研究中與蜂毒肽組和5-FU組比較，聯合組G0/G1期細胞比例增加，S期與G2/M期細胞比例降低，且聯合組細胞凋亡率更高，說明聯合使用蜂毒肽和5-FU可以將細胞阻滯在G0/G1期，促進細胞凋亡。此外，本研究中，聯合組腫瘤生長第30天的腫瘤生長抑制率較蜂毒肽組和5-FU組升高，說明蜂毒肽可協同增強5-FU抗腫瘤效果。研究顯示[11]，蜂毒肽可抑制非小細胞肝癌A549細胞的增殖，促進其凋亡。由此，蜂毒肽與5-FU聯合應用可促進癌細胞對5-FU的敏感性，聯合使用比單一使用效果更好。本研究中，蜂毒肽組、5-FU組、聯合組Smac、cleaved Caspase-3、Cyt C、Bax表達增加，且聯合組增加更顯著。Bax是促細胞凋亡蛋白，正常情況下會在線粒體膜外抑制Cyt C與Smac的釋放。但在外界刺激的作用下Bax會轉移到線粒體膜上，破壞線粒體膜的完整性，導致Cyt C與Smac從線粒體中釋放，誘發細胞凋亡[12]。蜂毒肽可以通過激活線粒體凋亡途徑，誘導胃癌細胞SGC-7901細胞的凋亡，Smac與Cyt C蛋白的表達顯著上升[13]。

綜上，蜂毒肽可增強人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞對5-FU的敏感性，蜂毒肽和5-FU聯合使用可以將A431細胞有效阻滯在G0/G1期，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，這一作用可能是通過激活線粒體凋亡途徑實現的。