骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達及意義研究

高發鵬 付波 于洪濤 田銳 楊佳霖 黃志

骨折是目前常見的骨科疾病之一，同時也是目前已知愈合時間較長的疾病之一[1]。但就目前已知的和臨床常用的促進骨折愈合的藥物存在著諸多問題[2]。目前約有2.5%～4.0%的患者出現骨折不愈合情況[3]。對于這種情況目前臨床常見的處理方式是進行二次手術，或者是使用促進骨折愈合的藥物，但療效仍存在諸多不穩定的情況[4]。所以就目前的情況臨床上急需一種可以促進骨折愈合，同時可以降低骨折不愈合發生的藥物。而硒蛋白P（selenoprotein P，SepP）作為目前已知的較為特殊的一種蛋白質，在抗炎、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤方面具有很重要的作用。但是由于其實驗檢測方式不同，導致其在人體中含量測度存在差異[5]。有研究表明其通過氧化應激的方式可以促進創傷的愈合，為本研究提供思路[6]。所以研究依據此為思考點，探究硒蛋白P與骨折愈合的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所選取的時間段為2019年5月—2021年10月，研究以10周齡，7只雄性大鼠體重300～400 g [SYXK（黑）2016-014] 的SD大鼠（sprague dawley，SD）大鼠外周血作為實驗樣本，通過蛋白免疫印跡（westorn blot，WB）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-PCR，RT-PCR）的試驗方法分別對大鼠愈合階段逐步分析硒蛋白P與骨折愈合的關系。動物飼養按照《實驗動物護理和使用指南》第8版進行飼養，14只SD大鼠10周齡，7只雄性大鼠體質量300～400 g，平均（354.41±2.45）g，7只雌性大鼠180～270 g，平均（254.41±1.98）g，處死大鼠，分離血清和組織以供進一步分析。

1.2 方法

RT-PCR收集各組分大鼠的血液樣本。分別提取大鼠的用Trizol試劑提取血液核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）樣本。在無周圍組織的情況下制備骨骼，并在液氮下使用Mikro二膜機（B.Braun，Melsungen，德國）在teflon膠囊中用鋼球研磨成粉末。根據制造商的說明，使用TRIzol?試劑（德國Erlangen PEQLAB）從脛骨和股骨粉末中提取總RNA。RNA樣本于-80℃下保存。反轉錄成cDNA文庫于-20℃下保存，將cDNA通過PCR反應檢驗基因表達情況，引物詳見表1。

表1

1.3 Western Blot檢測蛋白變化

將樣本取1 μL蛋白樣本與4× Loading buffer，100℃煮樣5 min，晾干后于-20℃分裝凍存。取10 μL蛋白質進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。分離膠采用10%，濃縮膠采用5%。初始電壓80 V，45 min，調整電壓至120 V，45 min，停止電泳。拆除電泳裝置，除去濃縮膠部分，切留含目的蛋白的分離膠部分。將濾紙等物品浸泡于轉膜液中，將PVDF膜剪去右上角，于甲醛溶液中浸泡激活1 min后放入轉膜液備用。合并裝置并按照正負極正確安裝裝置，連接電源100 V電轉100 min。在4℃條件下與一抗（1：1 000）孵育。室溫條件下將PVDF膜與二抗（1：5 000）孵育1 h。

1.4 統計學處理

通過單向方差分析和費羅尼校正（bonferroni correction，Bonferroni校正）多重比較試驗進行評估 。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 硒蛋白P受體低密度脂蛋白受體相關蛋白8重組蛋白（recombinant low density lipoprotein receptor related protein 8，Lrp8）在缺硒骨中的誘導情況

SepP及其受體Lrp8在骨骼中表達。分離、勻漿、SDSPAGE分級和Western Blot分析具有所示基因型的大鼠股骨。由于硒蛋白轉錄本數量較多，所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達。在已建立的SepP受體中，可檢測到Lrp8，缺失Lrp2；Lrp8在SepP/大鼠中強烈上調。對于第三個受試Lrp家族成員，即Lrp1，也遵守了類似的規定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前還存在爭議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性Seuptake的中央轉運體-受體對36，其蛋白質表達通過Western Blot分析進行評估。SepP在SepP+/+和SepP+/大鼠的股骨中可檢測到，其條帶遷移速度約為47、45和42 kDa。正如預期的那樣，SepP的表達在SepP/大鼠中無法檢測到（圖3A）。Lrp8在所有3種SepP基因型的骨骼中檢測到，其異構體在4 130和4 180 kDa遷移（圖3B）。Lrp8在骨骼中的表達強度幾乎與作為陽性對照組織的睪丸中的表達強度相似。因此，16塊骨骼為SepP介導的接受器提供了良好的裝備。在組織化學分析中，SepP可以檢測到，尤其是在礦化骨中，而軟骨是陰性的（圖3C和D）。具體見圖1所示。

圖1 SepP受體Lrp8在缺硒骨中的誘導情況

2.2 骨骼血液中硒蛋白P（SepP）硒的運輸情況

SepP作為骨骼硒轉運蛋白的作用，（1）-/-組大鼠硒相對濃度的百分比為（7.33±2.66）%，-/-tg大鼠硒相對濃度的百分比為（14.59±3.41）%，血清硒在SepP中僅輕微增加-/-tg與SepP的比較-/-大鼠P＞0.05，差異無統計學意義；（2）-/-大鼠股骨硒相對濃度的百分比為（44.55±4.23）%，-/-tg大鼠股骨硒相對濃度的百分比為（74.81±7.48）%，-/-大鼠脛骨硒相對濃度的百分比為（60.81±5.21）%，-/-tg大鼠脛骨硒相對濃度的百分比為（75.45±7.32）%。-/-大鼠股骨組與-/-tg大鼠股骨組對比P＜0.001，差異有統計學意義。-/-大鼠脛骨組與-/-tg大鼠脛骨組對比P＜0.001，差異有統計學意義。SepP中股骨（陰影條）和脛骨（開放條）中的硒濃度顯著增加-/-tg大鼠與SepP大鼠的比較-/- 大鼠在肝細胞中表達SepP。并通過單向方差分析和Bonferroni校正多重比較試驗進行評估；（3）在正常情況下，膳食硒被肝細胞吸收，有效地插入SepP并運輸到優先供應的靶組織，包括骨骼。嚴重的硒缺乏或慢性肝病導致SepP缺乏和骨骼中的硒缺乏，導致某些硒蛋白的表達減少，以及作為骨骼SepP受體的Lrp8代償性上調。這些發現將SepP添加到骨健康的重要肝源性因素列表中，并作為肝性骨營養不良的潛在補充靶點。具體見圖2所示。

圖2 骨骼血液中硒蛋白P（SepP）硒的運輸情況

3 討論

必需微量元素硒（Se）在人類健康中起著重要作用。低硒狀態與癌癥等高風險相關，在大多數實驗動物和人類研究中均有報道[7]。死亡率已被證明與危重病和腎癌的血硒濃度呈負相關，這突出了硒作為一種基本元素的突出重要性微量營養素[8-10]。然而，由于硒取決于膳食硒，因此全世界人口的硒狀況差異很大，而膳食硒又受到農業食品生產所用土壤的決定性控制。全球膳食硒攝入量范圍為每天7～220 μg硒，歐洲大部分地區，亞洲和非洲必須被視為自然資源硒供應不足的地區[11-13]。此外，飲食偏好、個人基因型和一般健康狀況是硒代謝和狀態的重要調節因素。攝入減少后，血清、肝臟、腎臟和其他組織中的硒濃度下降。值得注意的是，中樞神經系統和內分泌器官在很大程度上對有限的硒供應具有抵抗力。即使在嚴重缺硒的實驗模型中，這些器官仍保持其特有的硒狀態。在組織水平和不同的硒蛋白方面都觀察到了這種硒狀態的等級依賴性，確保即使在嚴重缺硒的情況下，最基本的硒依賴過程仍能在特權組織中維持[14-17]。本研究提出骨折愈合期血液中硒蛋白P的表達及意義的實驗分析，以此來進一步明確硒蛋白P與骨折愈合期血液之間的表達及意義，為臨床疾病的治療提供一些參考。

研究顯示，骨折愈合期血液中，SepP受體Lrp8在缺硒骨中被誘導，由于硒蛋白轉錄本數量較多，所有硒代謝和硒蛋白生物合成的必要因素也在骨骼中表達。在已建立的SepP受體中，Lrp8可檢測到，Lrp2缺失；Lrp8在SepP中強烈上調-/- 大鼠。對于第三個受試Lrp家族成員，即Lrp1，也觀察到類似的規定。Lrp1是否也有助于SepP的攝取目前仍存在爭議。由于已建立SepP和Lrp8以形成組織特異性硒攝取的中央轉運體-受體對，通過Western Blot分析評估其蛋白質表達（圖1）。SepP可在SepP+/+和SepP的股骨中檢測到+/- 在大約47、45和42 kDa遷移帶的大鼠。正如預期的那樣，SepP在SepP中的表達是不可檢測的-/- 大鼠（圖1A）。Lrp8在所有三種SepP基因型的骨骼中都檢測到，其異構體在＞130和＞180 kDa遷移（圖1B）。Lrp8在骨骼中的表達強度幾乎與作為陽性對照組織的睪丸中的表達強度相似。因此，骨骼為SepP介導的硒攝取做好了充分準備。接下來測試了骨骼血液中是否能夠通過使用循環SepP有效地增加其硒狀態，即SepP是否將硒從肝臟血液運輸到骨骼。為此，SepP-/-對僅在肝細胞中表達人SepP轉基因的大鼠進行分析。血清中的硒濃度僅受到轉基因的輕微影響（圖2A）。相比之下，SepP的股骨和脛骨中的硒濃度-/-與SepP相比，轉基因可有效提高tg-/- 大鼠（圖2B）。值得注意的是，SepP中的骨硒濃度-/-tg大鼠幾乎達到雜合子SepP水平+/- 大鼠，盡管轉基因對血清硒的貢獻很小。這一發現表明，通過肝源性SepP可以有效地將硒轉運到骨骼中（圖2C）。

硒主要以硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）的形式發揮作用，Sec是第21種蛋白質生成氨基酸。Sec依賴性硒蛋白分別由一組25個人類和24個大鼠基因編碼。10硒蛋白的生物合成需要在硒蛋白轉錄本的開放閱讀框內重新編碼UGA終止密碼子。Sec與生長中硒蛋白的共翻譯摻入取決于一組Sec特異性反式和順式作用因子的相互作用，包括Sec負載的tRNA[Ser]Sec，硒蛋白轉錄本中的Sec插入序列（selenocysteine insertion sequenceelement，SECIS）元 件，該元件由限速RNA結合因子SECIS結合蛋白-2（SECIS binding protein 2，SBP2）識別11此外，已經描述了參與細胞內硒代謝的兩種硒結合蛋白，即56 kDa硒結合蛋白-1（recombinant selenium binding protein 1，SELENBP-1）和14 kDa脂肪酸結合蛋白-1（human liver fatty acid binding protein，FABP-1）。在細胞內，硒被釋放并還原為硒化物，然后被依賴于硒的磷酸硒合成酶-2（abstract selenophosphate synthetase 2，SEPHS2）磷酸化。同時，磷酸化的絲氨酸tRNA激酶（pro-teinserine / threoninekinase，PSTK）使絲氨酸負載的tRNA[Ser]Sec磷酸化。這兩種富含能量的底物結合到Sec負載的tRNA[Ser]Sec是由P-Ser-tRNA:SectRNA催化的。Sec特異延伸因子EFsec和核仁蛋白（NCL）最終與其他翻譯因子一起促成Sec的共翻譯插入。

在哺乳動物硒蛋白中，硒蛋白P是獨特的，因為它攜帶每個蛋白質的多個Sec殘基，并構成血液中硒的大部分。硒蛋白P決定性地有助于大腦和睪丸的分級硒供應。脂蛋白受體相關蛋白（lipoprotein receptor associated protein，LRP）的兩個受體已確定該家族為硒蛋白P受體，即Lrp2和Lrp8。血清硒和硒蛋白P濃度在廣泛的營養硒攝入范圍內相關。一旦硒供應充足，硒蛋白P生物合成即達到飽和，從而獨立于進一步的硒攝入。觀察到硒蛋白P最大表達的閾值用于確定硒的最佳營養攝入范圍。在具有改良硒蛋白P表達的大鼠模型中分析了硒蛋白P的生理作用。純合子硒蛋白P敲除（硒蛋白P-/-）大鼠表現出具有組織特異性硒缺乏、生長率降低、共濟失調和男性特異性不育的硒依賴表型。Lrp8基因敲除大鼠復制了神經表型，突出了大腦硒穩態對硒蛋白P和Lrp8的相互依賴性。硒對骨骼的核心重要性正日益被認識。在低膳食硒攝入下，嚙齒類動物的骨骼表型以發育不良的皮質和小梁礦化為特征。在人類中，硒缺乏與大骨節病相關，一種地方性退行性骨關節炎，可通過補充硒預防。患有SBP2遺傳缺陷的受試者表現出硒蛋白表達減少，血液中甲狀腺激素模式紊亂，骨發育持續顯著延遲，身材相對矮小。最近，筆者報告血清硒蛋白P濃度與骨轉換和骨密度的標志物相關。在研究中，評估了硒蛋白P對骨硒代謝的重要性。

研究結果表明，骨動態表達硒蛋白P受體Lrp8，并依賴肝源性硒蛋白P有效攝取硒，因此代表了優先供應的靶器官在組織特異性硒供應層次中居高不下，類似于大腦和經典內分泌器官。現有研究分析來看，這種代謝特權是完全有道理的，因為骨骼與大腦和內分泌器官對生長和生存同樣重要。到目前為止，這種對低細胞內硒水平的代謝反應是骨骼所特有的。SepP攝取和細胞內硒代謝的這種動態適應是否代表了硒缺乏時SepP靶組織的更一般機制，有助于腦和內分泌器官等重要組織的分級供應，并在硒缺乏時保護重要的硒依賴過程，還有待觀察。