膽鈣化醇餌粒高效液相色譜分析方法研究

王玉萍，雷 琪，付萍萍，馬 暢

(陜西省農業檢驗檢測中心，陜西 西安 710003)

1 前言

膽鈣化醇滅鼠劑是一種安全性好、可以防治對抗凝血滅鼠劑產生抗藥性的新型滅鼠劑，在美國、新西蘭等發達國家得到廣泛應用，我國也于2012年獲得登記[1]。膽鈣化醇又名維生素D3，是一種對人類及高等動物生長、發育、繁殖、維持生命和保證健康不可缺少的脂溶性維生素，其主要作用是調節鈣、磷代謝，促進腸內鈣、磷的吸收和骨質鈣化，維持血鈣和血磷的平衡，在食品、飼料、醫藥等領域廣泛應用多年[2]。

2 試驗部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；膽鈣化醇標樣：已知質量分數，ω≥99.9%；膽鈣化醇0.075%餌粒。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent 1 260，具有二極管陣列檢測器和自動進樣器；Agilent色譜工作站；色譜柱：150mm×4.6mm(i.d.)不銹鋼柱，內裝ZORBAX SB-C18、5μm填充物。

2.3 液相色譜操作條件 流動相：Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5，經濾膜過濾，并進行脫氣；流量：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：264nm；進樣體積：5μL；保留時間：膽鈣化醇約12.6min。典型的膽鈣化醇的標樣、樣品色譜圖(圖1、圖2)。

圖1 膽鈣化醇標準品液相色譜圖

圖2 膽鈣化醇0.075%餌粒試樣液相色譜圖

2.4 測定步驟

2.4.1 標樣溶液的配制 稱取膽鈣化醇標樣0.05g(精確至0.000 1g)于100mL容量瓶中，用70mL甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，用移液管移取上述溶液2.0mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取研磨后的3.0g(精確至0.000 1g)膽鈣化醇餌粒樣品于具塞錐形瓶中，加入70mL甲醇，55℃超聲35min，冷卻至室溫，轉移至100mL容量瓶中，多次潤洗定容至刻度并搖勻，靜置備用。

2.4.3 測定 在上述操作條件下，待儀器穩定后，連續注入數針標樣溶液，直至相鄰2針膽鈣化醇峰面積相對變化<1.2%后，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標樣溶液中膽鈣化醇峰面積分別進行平均。試樣中膽鈣化醇質量分數按公式(1)計算：

(1)

式中：

ω1——試樣中膽鈣化醇質量分數，%；

A2——試樣溶液中膽鈣化醇峰面積的平均值；

m1——膽鈣化醇標樣的質量，g；

ω——標樣中膽鈣化醇質量分數，%；

A1——標樣溶液中膽鈣化醇峰面積的平均值；

m2——試樣的質量，g。

f——稀釋倍數，f=25。

3 結果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據膽鈣化醇物化性質和國家標準《GB/T 17818-2010 飼料中維生素D3的測定 高效液相色譜法》，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以甲醇和水作為流動相。為了得到更好的分離效果和峰形，將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，隨著甲醇比例的減少，保留時間增加，當甲醇與水比例達到97：3時，有雜質峰干擾膽鈣化醇，峰純度達不到試驗要求，最終選擇Ψ(甲醇 ：水)=95 ：5作為流動相，流速1.0mL/min。該條件下，膽鈣化醇色譜峰峰形較好，與雜質能完全分離，具有良好的精密度和準確度，并且分析時間較短，提高了工作效率。

3.2 檢測波長的選擇 通過Agilent1260高效液相色譜儀的光譜數據采集功能，經紫外光譜掃描膽鈣化醇的最大吸收波長約在210nm和264 nm處，在210nm處靈敏度較高，但干擾較大，在第二大吸收波長264nm處靈敏度尚可，且干擾較小，能夠滿足分析要求，故將檢測波長確定為264 nm(圖3)。

圖3 膽鈣化醇的紫外光譜圖

3.3 樣品配置過程的優化 由于餌粒制劑的特殊性，樣品稱取前必須充分研磨，且避光保存，在樣品超聲過程中，分別對超聲溫度和超聲時間進行了梯度比對，最后確定在55℃超聲35min后，樣品中膽鈣化醇能夠充分溶解。

3.4 分析方法的線性相關性試驗 按2.4.1標樣溶液的制備方法配制6.4～63.7mg/L 5個不同濃度的有效成分線性相關溶液，分別標記為STD1至STD5。在上述操作條件下，待儀器穩定后，按照STD1至STD5的順序測定每個溶液中膽鈣化醇的峰面積，取兩次測定的平均結果。以膽鈣化醇質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程為y=25.446x+29.228，相關系數r=0.999 8(圖4)。

圖4 膽鈣化醇線性關系圖

3.5 分析方法的精密度試驗 按2.4.2試樣溶液的制備方法配制5個0.075%膽鈣化醇餌粒精密度溶液，以有效成分線性相關溶液STD3為標樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，按照標樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標樣溶液的順序進行測定，結果(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗結果

3.6 分析方法的準確度試驗 稱取約1.5g(精確至0.000 1g)膽鈣化醇的0.075%膽鈣化醇餌粒于100 mL容量瓶中，再分別加入2.4.1中膽鈣化醇標準溶液母液約2.0mL，按2.4.2試樣溶液的制備方法配制5個有效成分準確度溶液，以線性相關溶液STD3為標樣溶液，在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，按照標樣溶液、準確度溶液、準確度溶液、標樣溶液的順序進行測定，結果(表2)。

表2 分析方法的準確度試驗結果

3.7 方法特異性 本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別膽鈣化醇。膽鈣化醇標樣、0.075%膽鈣化醇餌粒的膽鈣化醇HPLC-DAD峰純度均>990，有效成分處無其它物質干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖(圖5、圖6)。

圖5 膽鈣化醇標樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖6 0.075%膽鈣化醇餌粒HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結論

本文建立了檢測膽鈣化醇餌粒中有效成分質量分數的高效液相色譜分析方法。試驗結果表明，膽鈣化醇在測試濃度范圍內線性關系良好，有較高的準確度和精密度，具有分離效果好，分析時間短，操作簡便等特點，符合定量分析要求，是一種高效、快速、準確的分析方法。